高效離心分配色譜(HPCPC)分離純化蘋果樹枝中的根皮苷

摘 要：根皮苷是蘋果中主要的水溶性多酚化合物，對人體具有多種生理保健功能。為了獲得高純度的根皮苷，運用高效離心分配色譜技術對蘋果樹枝乙醇提取物中的根皮苷進行分離純化。對兩相溶劑體系、轉子轉速和流動相流速等參數進行系統的優化實驗。結果表明，最佳兩相溶劑系統為正己烷－乙酸乙酯－甲醇－水(1：5：1：5，v/v)，上相有機相為固定相，下相水相為流動相，轉子轉速為1500r·min^-1，流速為3.0mL·min^-1，紫外檢測波長為287nm。在此條件，在30min內，從純度為17.91％蘋果樹枝乙醇提取物中一步分離純化得到根皮苷，高效液相色譜法測定其純度為91.20％，根皮苷的回收率為98.10％。

關鍵詞：蘋果：高效離心分配色譜(HPCPC)；根皮苷；分離；純化

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04－645－05

根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，屬于植物黃酮類中的二氫查爾酮苷，它存在于多種植物中，例如，薔薇科草莓、多穗柯、犬薔薇。蘋果中含有大量的根皮苷，在蘋果樹葉中，二氫查爾酮根皮苷占總水溶性酚類化合物的90％以上。最近10a來，科學家做了大量關于根皮苷和根皮素在醫學、營養學以及食品工業等的研究。例如，利用根皮苷治療糖尿病、代謝綜合征和神經性疾病、增強記憶力、預防骨質疏松以及將根皮苷用做天然甜味劑制備天然食用黃色素等。隨著對根皮苷藥效作用的進一步發現和證實，對根皮苷的研究、開發和利用將會為人類帶來更大的利益。

高效離心分配色譜技術(high performance cen－trifugal partition chromatography，簡稱HPCPC)是液相色譜新技術，它是基于日本學者Nunogaki K發明的“CPC”(離心分配色譜儀)的優點進一步開發的。CPC屬于現代逆流色譜的一種，它是一種液液分配色譜，具有逆流色譜的以下共同優：(1)不用固體支撐體，避免了物質的不可逆吸附、失活和變性等；(2)有廣泛的兩相溶劑體系可供選擇，大大增加其使用范圍；(3)操作成本低，制備量大；(4)操作靈活，固定相和流動相之間可以互換使用。鑒于CPC的良好的分離純化性能，已被廣泛應用于天然產物和中藥有效成分的分離純化。作者采用HPCPC首次對蘋果樹枝乙醇提取物中分離得到根皮苷進行分離純化，以獲得高純度的根皮苷。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蘋果樹枝。2008年11月28日，采樣于中國農業科學院鄭州果樹研究所蘋果資源圃。取休眠期的蘋果樹枝樣，要求取樣枝條健壯發育正常，去掉其上的芽孢與殘葉。

根皮苷標準品，購于Sigma公司；HPLC分析用甲醇、磷酸為色譜純試劑分別購于山東禹王集團和美國迪馬公司；粗提物的制備及HPCPC分離用試劑(正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等)均為分析純；實驗用水為實驗室自制超純水(Milli-Q.18.2MΩ，25℃)。

1.2 儀器與設備

Waters高效液相色譜儀(含1525二元泵、2487雙通道紫外檢測器、Breeze色譜管理軟件等)、SPECORD50型紫外／可見分光光度計(德國AnalytikJena AG)、RE52A旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)、植物粉碎機、高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)、Milli-Q超純水設備(美國Millipore)、冷凍干燥機(德國Christ公司)、高效離心分配色譜儀CPC80(日本SIC)等。

1.3 根皮苷乙醇粗提物的制備

取陰干的蘋果樹枝，用植物粉碎機粉碎均勻，備用。

稱取一定量蘋果樹枝的粉末，用80％乙醇水溶液，料液比1：20，60℃恒溫水浴震蕩提取2次。每次提取90min，合并2次濾液，旋轉減壓濃縮，殘留物真空冷凍干燥后，置于干燥器中備用。

1.4 分配系數的測定

配制不同比例的兩相溶劑體系，劇烈振蕩使各溶劑充分混合，靜置過夜，分離兩相。取出4.00mL上相溶液，置于一試管中，加入適量的根皮苷粗提物，劇烈振蕩使之完全溶解，取出0.40mL該溶液，減壓濃縮干燥后，殘留物溶解于2mL的50％甲醇，0.22um微孔濾膜過濾后，經HPLC儀測定，設所測定根皮苷的峰面積積分值為A。

取出2.00mL上述溶液，置于離心管中，并向該離心管中加人2.00mL下相溶液，劇烈振蕩使溶質在兩相間分配，離心10min，靜置片刻達分配平衡后，取出0.40mL下相溶液，減壓濃縮干燥后，殘留物溶解于2mL的50％甲醇，0.22um微孔濾膜過濾后，再經HPLC儀測定，設所測定根皮苷的峰面積積分值為B。則根皮苷在該溶劑體系中的分配系數為K=B/(A-B)。

1.5 兩相溶劑系統及樣品溶液的制備-

本實驗經過系統篩選最終確定分離根皮苷的溶劑體系為：正己烷E，酸乙酯-甲醇-水(1：5：1：5，v／v)，按其比例分別將各種溶劑加入分液漏斗中，劇烈震蕩各溶劑充分混合，分相平衡后，分取上相和下相溶液，使用前分別用超聲波脫氣30 min。

取150 mg根皮苷乙醇粗提物，溶于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：5：1：5，v／v)下相中，劇烈振蕩使之完全溶解，以備HPCPC進樣。

1.6 HPCPC分離過程

在HPCPC分離純化過程中，兩相溶劑體系中的上相和下相都可以作為流動相。本實驗采用上相(有機相)作為固定相(下降洗脫模式)，旋轉之前，首先將固定相以10mL·min^-1流速充滿轉子。然后調節轉子轉速至1500r·min^-1，流動相流速為3.0mL·min^-1的下降洗脫模式泵入HPCPC轉子中。當流動相從柱中流出時，系統達到流體動力學平衡，待測樣品溶于下相注入進樣閥進樣。經色譜柱流出的分離產物在287nm下紫外檢測器連續檢測，進行3次重復實驗。將根皮苷峰對應的收集液濃縮，冷凍干燥，得根皮苷純化產物，待測。

1.7 固定相保留率的測定

1.6HPCPC分離過程中，系統達到流體動力學平衡時，測量被流動相推出的固定相的體積V，按下式計算固定相的保留率S_F=(V_總-V_出)/(_總-_環)×100％式中，V_總為管路總體積(mL)，V_總為流動相推出的固定相體積(mL)，V_環為進樣環的體積。

1.8 根皮苷的高效液相色譜分析方法

色譜柱：Waters Symmetry C18柱(150mm×4.6mm，φ5um)；流動相為甲醇和pH為2.6的磷酸水溶液(50：50)，等度洗脫；柱溫為30℃；流速為0.6mL·min_總：檢測器：紫外檢測器，波長：287nm。

2 結果與分析

2.1 蘋果樹枝乙醇粗提物的純度分析

圖1為蘋果樹枝乙醇粗提物的HPLC圖譜，根據根皮苷的峰面積歸一化計算可知根皮苷的純度為17.91％。

2.2 HPCPC溶劑體系的選擇結果

高效離心分配色譜分離過程中，首要的和最為關鍵的步驟是選擇合適的兩相溶劑體系。不同的溶劑體系因其黏度、密度、極性等性質的差異，從而對被溶解的同一組分產生不同的溶解、分配效果，致使分配系數有很大的差異。對于HPCPC來說，其中理想的分配系數K值應在0.67～1.5，最好接近于1。這樣目標化合物能夠均等的分配于兩相，并能得到滿意的分離結果。因此，從眾多溶劑體系中選擇一個適合HPCPC分離純化根皮苷的兩相溶劑體系，是本實驗的重點內容。

不同溶劑體系下根皮苷的分配系數測定值K，結果見表1。選用兩相溶劑體系為氯仿-甲醇-水(4：3：2，V/V)和氯仿-甲醇-水(7：13：8，V/V)，其K值僅為0.072和0.16，遠小于1。當用乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系，其K值則過大。在以上實驗數據的基礎上，結合Ito曾經建立的溶劑體系篩選方法，試驗較高極性的正丁醇－水(1：1)，其K值為18.77，這說明根皮苷主要在酯相中，這與乙酸乙酯-甲醇-水體系中根皮苷的分布于酯相情況相符。因此以脂溶性稍強的溶劑體系進行測定，選擇正已烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系，從脂溶性強的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：1：1：1)開始試驗，依次試驗了幾個不同的比例，最終得到了一個分配系數K值為0.994的兩相溶劑體系系，烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：5：1：5，V/V)。

2.3 HPCPC分離條件的優化

在室溫下，分別對流動相流速和轉子轉速進行系統性優化。

設定轉速為1500r·min_-1，進樣量為0.25mL，流動相流速分別為2.0，2.5，3.0，4.0mL·min_-1時的分離效果。實驗結果表明，隨著流動相流速的提高，雖然固定相的保留體積會略有減少，分離度降低，但可大幅度縮短分離時間，同時完成一組分離過程時溶劑的消耗基本沒有變化。在保證分離度的前提下盡可能縮短分離時間，因此選用較大流速3.0mL·min_-1。

當設定流速為3.0mL·min_-1，進樣量為0.25mL時，考察轉子轉速分別為600，800，1000，1200，1500r·rain_-1時，轉速對HPCPC分離效果的影響，如圖2。當轉速分別為600r·min_-1和800r·min_-1時，分離度較低，且固定相保留率S_F過低，分別為37％和44％，不能將目標組分根皮苷同其他組分很好的分開。轉速達到1000r·min_-1以上時，固定相保留率S_F為52％，分離效果明顯好轉(圖2)，同時考慮到增大轉速可以提高固定相的保留率，以提高轉子中固定相保留體積，使分離效果更佳，所以最終選擇了轉速為1500r·min_-1，此時固定相保留率S_F為70％。

綜合各因素考慮，優化后的實驗參數為：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：5：1：5，V/V)，上相有機相為固定相，下相水相為流動相，轉子轉速為1500r·min_-1，流速3.0mL·min_-1，此時，固定相保留率為70％。

對HPCPC分離純化流份Ⅰ收集，由根皮苷標準品和分離產品的紫外一可見光譜掃描圖譜知，2者在240～400nm波長范圍內的吸收光譜相吻合，均在287nm波長處有最大吸收，并采用HPLC法進行分析，結果表明，該流份為一個單一色譜峰，參照根皮苷標準品色譜圖，確定該流份即為根皮苷，進行純度分析，根據HPLC圖譜的峰面積積分值，歸一化計算得根皮苷的純度為91.20％，計算得根皮苷回收率為98.10％(圖3)。

3 討論

本實驗采用HPCPC技術，以蘋果樹枝粗提物為原料，純化制備根皮苷。影響逆流色譜分離效果的因素，主要包括溶劑體系和儀器參數等因素。HPCPC作為逆流色譜的一種，其溶劑體系的篩選，應當滿足以下幾方面要求：1)不造成樣品的分解與變性；2)足夠高的樣品溶解度；3)樣品在系統中有合適的分配系數值；4)固定相能實現足夠高的保留。HPCPC應用研究的關鍵是溶劑體系的選擇。樣品分離效果的好壞和溶劑體系的選擇有直接的關系，人們對溶劑體系的選擇進行了大量的基礎研究。例如，Ito曾經建立了一套溶劑體系的篩選方法，從氯仿開始篩選溶劑體系。如果樣品在氯仿一甲醇一水體系中的分配系數K落在0.5～2內，那么通過調整溶劑體積比，或者用乙酸代替甲醇，或者用四氯化碳或二氯甲烷部分地代替氯仿。如果樣品更加不均勻地分布在其中一相中，說明氯仿體系已不適合樣品的分離，此時需要尋求覆蓋更加寬極性范圍的溶劑體系；Oka等從正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水5種溶劑中分別選出2～4種溶劑，按照一定的比例混合，組成了16種溶劑體系。這16種體系的極性由弱到強，覆蓋了很大的范圍，而且體系均具有揮發性，兩相比均保持在1左右。

目前有關根皮苷分離純化的研究，主要集中在大孔吸附樹脂法和柱層析法，例如Dong從多穗柯甜茶中提取根皮苷，以大孔樹脂初步分離，中性氧化鋁柱層析再次純化得到了高純度的根皮苷：謝陽等以荔枝果皮的乙醇提取物為原料，經過大孔樹脂吸附層析、固相萃取、高效液相色譜法分離純化后也得到了高純度的根皮苷。大孔吸附樹脂法和柱層析法雖可以處理大量樣品，但是不可逆吸附嚴重、分離效率低、花費時間長、操作繁瑣、并且溶劑消耗量很大；制備型HPLC的缺點也是很明顯的。其設備和載體填料價格很高，一次制備樣品量低，對樣品前期處理要求嚴格，有效成分被固相載體的不可逆吸附嚴重。本實驗采用HPCPC技術，以蘋果樹枝粗提物為原料，純化制備根皮苷。HPCPC是在液一液分配色譜的基礎上發展起來的新型色譜技術，可以在短時間內完成樣品的高效分離和制備，與高效液相色譜(HPLC)不同，HPCPC最大的優點在于每次的進樣量比較大，可以達到毫克量級，甚至克量級；同時，它不使用固相載體作固定相，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失和污染等缺點，使用液體固定相能節省昂貴的填料的費用，運行使用中的后續投入很低。此外，HPCPC還具有高效、快速、高負載力及高回收率等優點，對天然產物的分離具有很大的優勢，具有非常廣闊的應用前景。因此，本實驗以蘋果樹枝粗提物為原料，采用HPCPC技術，可以實現根皮苷高純度單體的一步分離純化與制備工作。

4 結論

首次利用高效離心分配色譜技術對蘋果樹枝乙醇提取物中的根皮苷進行分離純化。選擇溶劑體系為：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：5：1：5，V/V)，在轉子轉速為1500r·min_-1，流動相流速為3.0mL·min_-1條件下，通過一步分離純化將純度為17.91％的根皮苷提取物純化到91.2％，根皮苷的回收率為98.1％，為制備高純度根皮苷提供了一個高效易行的方法。