基于EST的獼猴桃SSR標記的建的建立

摘 要：利用NCBI公共數據庫最新公布的獼猴桃EST(Expressed Sequence Tag)序列，開發獼猴桃的SSR(Simple se-quenceRepeats)標記。對來源于獼猴桃(Actinidia spp.)非冗余EST數據庫(NCBI dbEST)的56 400條基因序列使用SSRHunter1.3軟件進行了SSR篩查，從中共獲得了7939條SSR。應用Primer5.0軟件設計合成了85對獼猴桃EST-SSR引物，從中篩選出可進行熒光標記的6對引物：Ad01、Ad02、Ad03、Ad09、Ad42、Ad72。利用該6對EST-SSR熒光標記引物在DNA測序儀上對獼猴桃種質的多態性進行了PCR檢測，結果表明均能清晰地產生多態性分離。研究結果表明，通過獼猴桃EST數據庫的發掘能夠有效地篩選到基因水平的SSR標記。

關鍵詞：獼猴桃：EST序列：SSR標記

中圖分類號：$663.4 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04-622-04

微衛星(microsatellite)是指以少數幾個核苷酸(一般為1～6個)為基本重復單位的多次串聯重復DNA序列，也稱簡單序列重復(simplemple sequence re-_peats，SSR)。EST(expressed sequence tags，表達序列標簽)是將mRNA在體外反轉錄成cDNA并克隆到載體構建成cDNA文庫，大規模隨機挑取cDNA克隆，對其5’端或3’端進行一步法測序后獲得的長約150～500bp的表達序列片段。一個EST代表生物體某種組織某一時期的一個表達基因，可以說EsT是基因的“窗口”，它能反映mRNA的信息，可代表生物體某種組織或細胞某一時間的一個表達基因。EST-SSR標記來源于相對保守的轉錄區域，較基因組SSR標記具有更高的通用性和保守性。EST-SSR標記具有開發簡便及成本低廉等優點，且EsT-SSR標記來自于基因的編碼序列，更容易獲得基因表達的信息，為功能基因的直接鑒定提供了可能性。目前，EST-SSR標記已成為重要農藝性狀定位、基因作圖、遺傳多樣性、比較基因組學研究的新型重要工具。

公共數據庫中的EST序列已逐漸發展成為尋找新型分子標記EST-SSR的主要數據來源。1991年先后啟動了擬南芥和水稻的EST計劃，當時各個公共數據庫中的EST數目不足2000條。目前，在dbEST數據庫登記EST信息最多的植物是玉米，達201.8萬條，其次是擬南芥、大豆、水稻和小麥，均超過100萬條。在dhEST數據庫中EST信息最豐富的果樹是葡萄，達353706條，其次是蘋果和柑橘，均超過20萬條。

迅速增長的EST數據為SSR標記的開發提供了豐富的來源，通過篩查EST來開發SSR標記是一條快速而有效的途徑。目前，在葡萄、柑橘、核桃等果樹中已成功開發了EST-SSR標記。前人的研究為果樹EST-SSR標記的開發打下了良好的基礎。截至2008年7月，NCBIdb EST數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)正式公布了13萬余條獼猴桃EST序列。據此，作者首次利用最新公布的獼猴桃EST數據庫，通過對獼猴桃EST序列的SSR信息分析，開發出基于EST的獼猴桃SSR標記，為今后獼猴桃的分子生物學研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為矮型獼猴桃贛獼5號、普通型獼猴桃奉雄2號及其F₁代分離個體。

1.2 獼猴桃EST-SSR的篩查

從NCBI db EST數據庫下載所有的獼猴桃EST序列，利用SSRHunter1.3軟件，對所有下載的EST序列進行SSR篩查。篩查的標準是：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重復次數分別為7次、5次、4次、4次、3次。

1.3 獼猴桃EST-SSR引物設計

應用Primer 5.0軟件設計獼猴桃EST-SSR引物，引物長度為18～24bp。研究共設計85對熒光引物，由上海捷瑞公司合成。

1.4 獼猴桃基因組DNA的制備

分別采集矮型獼猴桃贛獼5號、普通型獼猴桃奉雄2號及其F₁代分離個體新鮮嫩葉，采用CTAB法并加以改進提取其基因組DNA，在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳檢測DNA質量，將所有樣品的DNA濃度稀釋至10mg·L^{-1，-20℃保存備用。}

1.5 獼猴桃EST-SSR反應體系

PCR反應體系為15uL，內含模板DNA20ng，10×buffer 1.5uL，25 mmol·L_-1的MgCl₂ 1.2uL，dNTPs0.2，上游引物0.15uL，下游引物0.3/uL，M13(序列GTfTFCCCAGTCACGACGTFG)用量為0.3uL，TaqDNA聚合酶0.2U。PCR反應程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，經30個循環后，94℃變性20s，53℃退火20s，72℃延伸30s，12個循環，最后延伸20min，10℃保存，試劑為上海博彩公司產品。PCR產物的檢測采用熒光標記引物檢測，引物合成時采用熒光FAM標記5'端寡核苷酸。熒光標記產物在DNA測序儀(ABl3130)上電泳并收集數據。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃EST中的SSR篩查與引物的篩選

對來源于獼猴桃EST數據庫(NCBI db EST)的56400條單一基因序列使用SSRHunter1.3軟件進行了SSR搜索。結果表明，從中共獲得含SSR的EST序列7939條，SSR出現的頻率為14.08％，平均每2.48kb長度的EST出現1個SSR，即平均7個單一基因中存在1個SSR。其中包括二核苷酸重復5131條，三核苷酸重復1237條，四核苷酸重復284條，五核苷酸重復397條，六核苷酸重復890條，分別占總SSR的64.63％、15.58％、3.58％、5.00％和11.21％。其中，二核苷酸重復序列是最豐富的重復單元，其次為三核苷酸重復和六核苷酸重復(表1)。

應用Primer5.0軟件設計獼猴桃EST-SSR引物，結合自動與人工篩選共獲得85對熒光引物。以親本與F個體的DNA樣品為模板進行引物的篩選，從85對熒光引物中篩選出了6對多態性豐富的引物用于EST-SSR分析。

2.2 獼猴桃EST-SSR標記的建立

表2為用于建立獼猴桃EST-SSR標記而篩選的6對EST-SSR引物及重復單元信息。通過觀察引物Ad01、Ad02、Ad03、Ad09、Ad42、Ad72在瓊脂糖凝膠的電泳結果，從中可見瓊脂糖的檢測效率比較低，不能清楚分辨出親本(贛獼5號，奉雄2號)和普通型獼猴桃及矮型獼猴桃F。代分離個體間的差異。進一步利用該6對EST-SSR熒光標記引物在自動熒光DNA測序系統(ABl3130)上對獼猴桃種質的多態性進行了PCR檢測，結果表明均能清晰產生多態性分離。研究利用DNA測序儀及EST-SSR熒光標記引物對PCR產物進行檢測，檢測精度可以達到1bp，其分析準確性明顯高于瓊脂糖凝膠的電泳結果。研究結果證實，通過獼猴桃EST數據庫的發掘能夠有效地篩選到基因水平的SSR標記。

3 討論

應用SSRHunter1.3軟件對獼猴桃EST數據庫中的56400條基因序列進行了SSR搜索，從中共獲得7939條SSR，SSR出現的頻率為14.08％，平均每2.48kh長度的EST出現1個SSR。EST-SSR出現頻率與茶樹(15.48％)相近，但高于辣椒叫(10.7％)、白菜(10.34％)、核桃(10.27％)。SSR出現頻率的不同，是由于物種之間基因的差異。植物基因組中SSR出現頻率與該物種基因組大小和重復DNA序列所占的比例成負相關，而與基因組中轉錄部分的比例和低拷貝序列出現的頻率成顯著正相關。

在獼猴桃EST-SSR中，二核苷酸重復序列是最豐富的重復單元，其次為三核苷酸重復，它們分別占總SSR的64.63％和15.58％。而在擬南芥基因組的研究中發現，單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復的SSR所占比例分別為33％、30％、30％，且分布較為均勻。在大麥、玉米、大豆、黑麥、甘蔗和小麥中，三核苷酸重復的SSR最多，在54％～78％。葡萄、柑橘也以三核苷酸占主導。茶樹、杏樹和桃樹飼是以二核苷酸為主，研究證實獼猴桃也是以二核苷酸重復為主，它占到總SSR的64.63％。此外，獼猴桃中的六核苷酸重復所占比例達到11.21％，這在所報道的植物種類中還未見過，大麥、玉米、大豆、黑麥、甘蔗、桃樹、柑橘和茶樹等的六核苷酸重復比例一般都在3％12.2下。

在獼猴桃的EST-SSR分析體系中，引物的設計與篩選是必需的。引物不同，對DNA模板的結合力也不同；模板不同，對引物的反應力也不同，其擴增產物片段的大小、分布、緊密度都可能完全不一樣。本研究應用Primer 5.0軟件設計合成了85對獼猴桃EST-SSR引物，從中篩選出6對可做熒光標記的引物。利用該6對EST-SSR熒光標記引物在DNA測序儀上對獼猴桃種質的多態性進行了PCR檢測，結果表明均能清晰地產生多態性分離，其分析準確性明顯高于瓊脂糖凝膠的電泳結果，分辨精度可達1bp，這與張亞東等的研究結果一致。Fraser等利用中華獼猴桃與美味獼猴桃基因文庫分析cDNA序列篩選SSR，通過對二倍體中華獼猴桃雜種后代雌雄株的SSR分析，結果顯示出較高的基因多態性與較強的遺傳圖譜構建潛力。本研究則通過篩查EST數據庫開發出的多態性SSR引物，能清晰區分矮型獼猴桃、普通型獼猴桃及其F₁代個體，研究路徑更加便捷實用，可為獼猴桃EST-SSR分析檢測提供指導。

由此可見，通過獼猴桃EST數據庫的發掘能夠有效地篩選到基因水平的SSR標記。利用DNA序列測定儀及熒光產物檢測的方法是穩定可靠的，篩選出的多態性引物，具有很高的工作效率。EST是基因的“窗口”，它能反映mRNA的信息。EST-SSR標記具有通用性強、與性狀連鎖等特點。獼猴桃EST-SSR標記的建立，可為獼猴桃遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、功能基因定位與克隆奠定基礎。