美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)對(duì)嘧菌酯的敏感性

摘 要：采用孢子萌發(fā)法和菌絲生長速率法測(cè)定了我國北方地區(qū)美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯和水楊肟酸(sHAM)的敏感性，從而為測(cè)定室內(nèi)美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感性提供適合的SHAM濃度，并且為監(jiān)測(cè)田間抗藥性的發(fā)生提供依據(jù)。結(jié)果表明，當(dāng)質(zhì)量濃度為60mg·L^-1時(shí)，SHAM對(duì)43株美澳型核果褐腐菌菌絲的抑制率在-3，09％～52.93％，但同樣濃度下，SHAM對(duì)32株褐腐菌孢子萌發(fā)的抑制率在-0.73％～9.58％，方差分析的結(jié)果表明。濃度為60mg·L^-1的SHAM對(duì)褐腐菌的孢子萌發(fā)率無明顯抑制作用。嘧菌酯對(duì)55株美澳型核果褐腐菌的ECso分布頻率呈單峰曲線，ECso值在0.075～0.390mg·L^-1，平均值為(0.210±0.072mg·L^-1)，可以作為敏感基線。

關(guān)鍵詞：美澳型核果褐腐病菌；嘧菌酯：水楊肟酸

中圖分類號(hào)：S662 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碣：A 文章編號(hào)：i009—9980(2010)04—561—05

褐腐病是桃生產(chǎn)中的一種重要病害，主要由美澳型核果褐腐菌Monilinia fructicola (G.wint.)Hon—ev引起，該病菌主要侵染寄主的花和果實(shí)，造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。陳笑瑜等2003年對(duì)北京地區(qū)桃病害發(fā)生情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn)桃褐腐病在桃出庫后的24 h內(nèi)便開始發(fā)生，7d后平均爛果率達(dá)到60％。2003年Zhu等確定了北京地區(qū)桃褐腐病的病原菌為美澳型核果褐腐菌，是國內(nèi)的一個(gè)新記錄種。

在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是現(xiàn)階段防治桃褐腐病的主要方法。目前使用的殺菌劑有甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和代森錳鋅等，分別屬于苯并咪唑類、三唑類和硫代氨基甲酸酯類。嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類的殺菌劑，具有廣譜高效的殺菌活性，同時(shí)具有保護(hù)和治療作用。該藥劑于2008年在北京市平谷區(qū)開始使用，由于防效明顯，正在推廣使用。為了監(jiān)測(cè)美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感水平變化情況，有必要在嘧菌酯大量使用前建立這一病菌對(duì)嘧菌酯的敏感基線。

嘧菌酯是一種線粒體呼吸抑制劑，通過阻止細(xì)胞色素b和cl間電子轉(zhuǎn)移，抑制線粒體的呼吸，導(dǎo)致細(xì)胞不能產(chǎn)生ATP而使細(xì)胞死亡。前人的研究表明，當(dāng)正常的電子傳遞途徑被抑制后，植物病原真菌可以從旁路氧化途徑獲取能量。在田間，寄主植物會(huì)分泌類黃酮物質(zhì)抑制旁路氧化途徑，而在人工培養(yǎng)條件下，病原菌則可通過旁路氧化途徑獲取能量。因此為了能夠獲得美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯真實(shí)的敏感性，室內(nèi)測(cè)試時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入水楊肟酸(salicylhydroxamic acid，簡稱SHAM)打斷旁路氧化途徑，防止真菌從旁路呼吸或發(fā)酵途徑獲得能量。Luo等㈣在做美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯敏感性的實(shí)驗(yàn)中，用到的SHAM濃度是10μg·mL^-1，而在我們的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)100μg·mL^-1的SHAM對(duì)來自中國的一些褐腐菌菌絲的生長有較大的抑制作用，最高可達(dá)到65％，因此有必要找到一個(gè)合適的SHAM添加濃度，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：來自各地的美澳型核果褐腐菌58株(55株采自北京、山東、河北和浙江等地的病果，1株來自新西蘭，2株來自美國)(表1)。自采菌株全部經(jīng)過單孢分離，并采用Ioos等的方法鑒定為打ucti—cola。

藥劑：99％的嘧菌酯(Azoxystrobin)和99％的水楊肟酸均購自上海sigma公司。用甲醇溶解后，配制成1X10⁴mg·L^-1和5x10⁴mg·L^-1的母液備用。

1.2 方法

1.2.1 SHAM對(duì)美澳型核果褐腐茵菌絲生長的作用 隨機(jī)選擇7株菌進(jìn)行測(cè)定，以確定合適的SHAM添加濃度。SHAM的測(cè)定濃度為0、40、60和100mg·L^-1，將在21℃下培養(yǎng)4～5d的菌落邊緣上制取菌餅(直徑為0.5mm)，轉(zhuǎn)移至含藥PDA平板中央，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，6d后記錄褐腐菌的菌落直徑。按公式計(jì)算菌絲生長抑制率。由于在SHAM濃度為60mg·L^-1時(shí)有一株來自美國北卡羅納州的菌株的生長速率與對(duì)照沒有顯著性差異，為驗(yàn)證中國的其他菌株在60mg·L^-1下是否都有抑制情況的發(fā)生，選擇了43個(gè)菌株用以上的方法測(cè)定了在SHAM濃度為60mg·L^-1時(shí)的菌絲生長情況。抑制率(％)=對(duì)照的菌落直徑-處理的菌落直徑/對(duì)照的菌落直徑-0.5x100

1.2.2 SHAM對(duì)美澳型核果褐腐茵孢子萌發(fā)的作用 隨機(jī)選擇4個(gè)菌株進(jìn)行測(cè)定。從21℃下培養(yǎng)4～5d的菌落上收集孢子，制備濃度為2x10⁵個(gè)，mL^-1的孢子懸浮液，取0.1mL涂布于含0、40、60、100和150 mg·L-1 SHAM的水瓊脂培養(yǎng)基平板上。每濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在21℃下培養(yǎng)5h后，計(jì)算100個(gè)孢子的萌發(fā)率。由于在SHAM濃度為60mg·L^-1時(shí)4個(gè)菌株的孢子萌發(fā)率與對(duì)照沒有顯著性差異，為驗(yàn)證中國的其他菌株在60mg·L^-1時(shí)的孢子萌發(fā)情況，選擇了32個(gè)菌株用上述方法測(cè)定了在SHAM濃度為60mg·L^-1時(shí)的孢子萌發(fā)情況。

1.2.3 美澳型核果褐腐茵對(duì)嘧茵酯的敏感性從在21℃下培養(yǎng)4～5d的菌落上收集孢子，制備濃度為2x10⁵個(gè)·mL^-1的孢子懸浮液，分別涂布于含0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mg·L^-1嘧菌酯且含有60mg·L^-1SHAM的水瓊脂培養(yǎng)基平板上。每皿涂0.1mL，每濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在21℃下培養(yǎng)5h后，計(jì)算100個(gè)孢子的萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SHAM對(duì)美澳型核果褐腐菌菌絲生長的影響

所測(cè)的7株菌在含有40、60和100mg·L^-1SHAM的PDA培養(yǎng)基上的菌落大小各不相同，除菌株3RNC以外，其他菌株在含有SHAM的PDA上的菌落直徑與對(duì)照均有顯著差異(圖1)。在SHAM濃度為60mg·L^-1-1時(shí)，對(duì)43株美澳型核果褐腐菌的抑制率為3.09％～52.93％(圖2)，其中有2.3％的菌株表現(xiàn)為促進(jìn)生長的作用，對(duì)14.0％的菌株抑制率在15％以下，對(duì)67.4％的菌株抑制率在15％～40％，抑制率高于40％的菌株占16.3％。結(jié)果表明，含有40～100mg·L^-1，SHAM的培養(yǎng)基對(duì)大部分菌株的菌絲生長具有明顯的抑制作用。

2.2 SHAM對(duì)美澳型核果褐腐菌孢子萌發(fā)的影響

所測(cè)定的4個(gè)菌株在含有40和60mg·L^-1SHAM的水瓊脂上的萌發(fā)率和對(duì)照沒有顯著性差異，在100mg·L^-1時(shí)BLG3-2和L5-7與對(duì)照相比有顯著性差異，在150mg·L^-1時(shí)BNl81、BLG3-2和L5-7與對(duì)照有顯著差異(圖3)。所以，60mg·L^-1為不抑制4個(gè)菌株孢子萌發(fā)的最高濃度。在SHAM濃度為60mg·L^-1時(shí)，對(duì)32株美澳型核果褐腐菌孢子-萌發(fā)的抑制率為0.73％～9.58％(圖4)，其中對(duì)6.3％的菌株表現(xiàn)為促進(jìn)生長的作用，對(duì)93.7％的菌株表現(xiàn)為抑制作用，抑制率在10％以下。結(jié)果表明，含有60mg·L^-1 SHAM的培養(yǎng)基對(duì)大部分菌株的孢子萌發(fā)沒有明顯的抑制作用。為了確定此濃度是否可以打斷旁路氧化途徑，測(cè)定了未加SHAM和加SHAM2種情況下嘧菌酯對(duì)美澳型核果褐腐菌的EC₅₀。嘧菌酯對(duì)美澳型核果褐腐菌的ECho在含有60mg·L_-1SHAM培養(yǎng)基上測(cè)得的數(shù)值與在不含SHAM培養(yǎng)基上測(cè)得的數(shù)值有顯著的差異，說明60mg·L_-1是可以打斷旁路氧化途徑的，因此，在以后的測(cè)定嘧菌酯對(duì)美澳型核果褐腐菌的ECho濃度選用60mg·L_-1。

2.3 美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感性

嘧菌酯對(duì)來自各地的55株美澳型核果褐腐菌的ECso分布在0.075～0.390mg·L_-1最高與最低值之間相差5.19倍，平均值為(0.210～0.072)mg·L_-1。從圖5中可以看出ECso呈單峰的正態(tài)曲線分布，無亞群體出現(xiàn)，說明在供試菌株中沒有抗藥菌株出現(xiàn)，因此嘧菌酯對(duì)這55株菌的ECso的平均值可以作為美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感性基線。

3 討論

在室內(nèi)離體條件下測(cè)定植物病原菌對(duì)QoI類藥劑的敏感性時(shí)，SHAM通常用于打斷旁路氧化途徑，試驗(yàn)的結(jié)果表明，60mg·L_-1的SHAM濃度可用于用孢子萌發(fā)法，但不適用于用菌絲生長測(cè)量嘧菌酯對(duì)美澳型核果褐腐菌的抑制作用。研究還發(fā)現(xiàn)，同一濃度的SHAM對(duì)不同的褐腐菌株的抑制率也不同。張雅等舊在研究SHAM對(duì)灰葡萄孢菌株的抑制作用時(shí)也觀察到了類似現(xiàn)象，并推測(cè)是不同菌株中旁路氧化途徑存在差異。本研究的結(jié)果還表明，在相同的濃度下，SHAM對(duì)菌絲生長的抑制作用要大于對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用，推測(cè)是褐腐菌在菌絲生長和孢子萌發(fā)時(shí)能量的來源偏重有所不同。Luo等㈣在做美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯敏感性的實(shí)驗(yàn)中，用到的SHAM濃度是100mg·L_-1，而在本實(shí)驗(yàn)中60mg·L_-1的SHAM對(duì)大部分菌株的菌絲生長都有較大的抑制作用，這可能是不同地區(qū)的菌株在旁路氧化途徑方面也有一定的差異。

嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類的藥劑，2001年在我國登記上市，登記的作物病害有辣椒炭疽病、芒果炭疽病和柑橘瘡痂病等。在美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯敏感性的實(shí)驗(yàn)中用到的菌株都來自中國未使用嘧菌酯的地區(qū)，因此，此實(shí)驗(yàn)獲得的嘧菌酯對(duì)55株美澳型核果褐腐菌的EC₅₀分布曲線可以作為我國美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感基線。目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了Penicillium digitatum、Ascochyta rabiei和Cladosporium fulvum對(duì)嘧菌酯的敏感基線，還未建立美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感基線，P.digitatum對(duì)嘧菌酯的EC₅₀在0.020～0.260mg·L_-1，A，rabiei對(duì)嘧菌酯的ECso在0.018～0.034mg·L_-1，C.fulvum對(duì)嘧菌酯的EC₅₀在0.028～1.61mg·L_-1，本實(shí)驗(yàn)得到的EC₅₀在0.075～0.390mg·L_-1。與嘧菌酯對(duì)P.digitatum和C.fulvum的EC·范圍相似。由于近年來該藥劑的推廣，陸續(xù)在田間發(fā)現(xiàn)了Botrytis cinerea，Alternaria solani和Podosphaerafusca對(duì)嘧菌酯的抗藥菌株，因此在大面積推廣之前，建立美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的敏感基線，可以為今后監(jiān)測(cè)國內(nèi)的美澳型核果褐腐菌對(duì)嘧菌酯的抗藥性提供依據(jù)。

致謝：感謝美國加州大學(xué)Kearney農(nóng)業(yè)研究中心駱勇博士為實(shí)驗(yàn)提供部分褐腐菌株。