葡萄雄性不育種質特性及其花粉敗育的細胞學研究

摘 要：通過對‘2004-6-12’(魏可實生)、‘2004—2—30’(巨峰實生)及魏可(對照)葡萄花器官特征、花粉萌發率、花粉粒形態、成熟花粉粒內部結構以及花藥、小孢子發育過程細胞學特征的觀察，研究了葡萄雄性不育的特性。結果表明，‘2004—6-12’和‘2004—2—30’的花粉無生活力，花粉粒P／E值分別為(1.13±0.05)和(1.12±0.04)，均為近球形，且無發芽孔和發芽溝；花粉粒橫切面邊緣光滑，外壁紋飾分別為網狀和穴狀。魏可(對照)花粉粒極軸值與赤道軸值之比(P／E值)(2.11±008)，為長球形，萌發溝為三孔溝型，外壁紋飾為孔穴狀。‘2004—6—12’和‘2004—2-30’小孢子敗育主要發生在單核早期，但‘2004—6—12’在小孢子母細胞減數分裂期就表現出部分異常，表明2者的小孢子敗育可能與絨氈層提前解體有關。

關鍵詞：葡萄；雄性不育；花粉特性；細胞學特征

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980(2010104—514—07

葡萄為葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)植物，我國以栽培鮮食葡萄為主。當前，選育優質無核葡萄新品種已成為國內外，特別是發達國家葡萄育種的重要目標之一。無核葡萄根據其授粉結實的特性可分為單性結實和假單性結實(種子敗育型)兩類生產上獲得無核葡萄的途徑，一是選用無核品種，二是利用植物生長調節劑對有核品種進行無核化處理，促其形成無核果實。無論是由遺傳因素還是外在因素刺激形成的無核，其本身都需要有單性結實能力，而雄性不育是導致果實無籽的重要遺傳因素之一。

果樹上利用雄性不育作母本雜交可省去去雄過程，簡化育種程序，提高效率。目前，有關葡萄雄性不育和敗育的時期及其方式的研究較少。‘2004—6—12’(魏可實生)和‘2004—2—30’(巨峰實生)為南京農業大學選育的優良單株，前者自然授粉的果穗大小粒現象嚴重，出現大量無核果，花前套袋全為無核果實，雄蕊花絲短，且反卷；后者雄蕊花絲短，且反卷，花前套袋不結實，花穗枯萎。為確定‘2004-6-12’(魏可實生)和‘2004-2-30’(巨峰實生)的可育性，連續兩年對其進行鑒定試驗，探討2者雄性不育的敗育過程和途徑，旨在為分析和利用不育材料提供實驗依據。

1 材料和方法

‘2004-6-12’(魏可實生)、‘2004-2-30’(巨峰實生)分別為播種魏可、巨峰葡萄自交種子實生選種。于2004年春播種。當年6月定植。‘2004-6-12’(魏可實生)部分植株于第2年始花，大部分植株播種后第三年開花結果；2006年自然授粉果穗大小粒現象嚴重，出現大量無核果，2007年，花期觀察，雄蕊花絲短，且反卷。‘2004-2-30’(巨峰實生)于2007始花，2008年花期觀察，雄蕊花絲短，且反卷，花前套袋不結實，花穗枯萎。選用雄性不育種質‘2004-6-12’(魏可實生)、‘2004-2-30’(巨峰實生)為材料，以魏可(Wink)為對照，采集于南京農業大學基地。

1.1 花器外部形態觀察

盛花期(5月中下旬)田間觀察花蕾100個，從花序的上中下部位分別采集花蕾5個，使用德國產MoticK-400L體視顯微鏡拍照，觀察花器官外觀形態。

1.2 花粉制備

花前1周(4月中旬)將5穗花序套袋，采集初花期花蕾100個，在實驗室用鑷子取下大蕊花花藥2g于培養皿中，25℃培養24h，收集花粉，干燥、低溫條件下備用。

1.3 花粉生活力測定

取干燥、低溫條件下備用花粉參照胡適宜的離體萌發法培養，在100mL的蒸餾水中，加瓊脂1g，蔗糖10g，硼砂0.1g，燒杯中加熱煮沸，用玻棒滴一滴培養基于載玻片，冷卻后用毛筆蘸花粉少許，均勻撒于培養基表面，保濕，25～30℃培養24h。在光學顯微鏡100倍下檢測發芽情況，每個載玻片上統計5個視野的花粉粒數和萌發數。

1.4 花粉粒形態、大小觀察

花粉經處理后噴金鍍膜(日立E-1010離子濺射儀)，分別于2008年6月12日和2009年6月16日，在掃描電鏡(日立S-3000N型)下觀察拍照。結合2次拍照測量20粒花粉的赤道軸、極軸，計算極軸值(P)／赤道軸值(E)值，觀察、描述外壁紋飾。花粉形狀分類參照王開發P／E比值法；大小分類參照牛立新等應用標準差法對葡萄花粉粒大小提出的分類標準。

1.5 花粉粒內部結構觀察

花粉經含2.5％的戊二醛的多聚甲醛初固定12h以上，1％四氧化鋨后固定2h，丙酮梯度脫水，Epon 812環氧樹脂包埋，經power tome-XL型超薄切片機制成70nm切片，經醋酸雙氧鈾和檸檬鉛雙染色(醋酸雙氧鈾30min，檸檬酸鉛30min)，于2009年6月17日在日立H-7650透射電鏡觀察。

1.6 花藥及小孢子細胞學觀察

‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可分別從幼蕾期到初花期(2008年、2009年4月中旬一5月中上旬)，每4d采樣1次，FAA固定，4℃保存。參照常規石蠟切片法制片㈣，用光學顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2，1 花器外部形態觀察

與魏可相比，‘2004-6-12’和‘2004-2-30’開花后花器官外部結構表現出雄蕊花絲短，花藥反卷，且整穗花序中花絲翻卷率為100％，呈葡萄雄性不育(雌能花)的外觀形態(圖版I-A1、A2、A3)。

2.2 花粉生活力的測定

‘2004-6-12’、‘2004-2-30’花粉粒無萌發，萌發率為0，而魏可花粉粒發芽達85.1％，可見‘2004-6-12’、‘2004-2-30’不具有發芽能力(表1)。

2.3 花粉形態學觀察

對‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可花粉粒掃描電鏡觀察結果表明，花粉粒與魏可形態存在較大差異(圖版I)。‘2004-6-12’花粉粒P／E=(1.13～0.05)，‘2004-2-30’花粉粒P／E=(1.12～0.04)，均是近球形(圖版I-B1、B2)，魏可P／E值為(2.11～0.08)，形狀為長球形(或者稱為橢球形)(圖版I-B3、B7)，極道面觀為鈍三角形(圖版I-B8)。

2.3.1 花粉粒的大小比較從表1中可以看出，‘2004-6-12’極軸(P)為(24.53～2.78)(20.36～27.67)，屬于雌能花中的中型花粉類型，‘2004-2-30’極軸(P)為(32.18～1.57)(28.87～34.00)屬于大型花粉，魏可極軸(P)(29.79～1.63)(29.38～30.20)均屬于中型花粉類型。

2.3.2 花粉粒的表面紋飾比較‘2004-6-12’單株花粉粒壁紋飾為網狀(圖版I-B4)，‘2004-2-30’表面紋飾為穿孔狀(圖版I-B5)，而魏可紋飾為穴狀(圖版I-B6)。花粉萌發孔，從花粉粒電鏡觀察發現，魏可的花粉均為三溝孔型，極道面上為鈍三角形，萌發溝中通常有清晰的萌發孔。萌發孔上附有乳頭狀突起(圖版I-B6)，但‘2004-6-12’、‘2004-2-30’的飽滿花粉均未發現有萌發溝和萌發孔的存在。

2.4 花粉粒內部結構觀察

對‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可成熟花粉粒進行隨機切片，在透射電鏡下觀察內部結構。結果表明，‘2004-6-12’、‘2004-2-30’花粉粒橫切面為近圓形(圖版I-Cl、C2)，橫切面周邊較光滑，沒有發現花粉粒發芽溝凹陷，進一步說明花粉粒沒有發芽溝；內部結構內含物質地不均勻(圖版I-C4、C5)。魏可花粉粒橫切面周邊粗糙(圖版I-C6)，有3條萌發溝凹陷(圖版I-C3)，內含物質地緊密。

2.5 花藥細胞學觀察

‘2004-6-12’、‘2004-2-30’與魏可花蕾造孢期橫切面相同，含4-5枚雄蕊，每一花藥由4個花粉囊和1個藥隔組織構成(圖版Ⅱ-B1)，花藥橫切呈蝶形，花粉囊壁由表皮層、藥室內壁、中層和絨氈層組成，呈同心圓排列，圓心處為花粉母細胞(圖版Ⅱ-A1)，其特點為：細胞質濃厚、液泡小、細胞核大，至花粉母細胞時期3個供試材料發育無明顯差異。

減數分裂時期，魏可小孢子母細胞之間形成胼胝質壁，細胞逐漸分散開來，此時絨氈層具退化痕跡細胞形狀開始不規則，排列也疏松且多為2～4個核仁；中層細胞變扁平，儲藏物質減少，以后逐步被吸收(圖版Ⅱ-A2)。‘2004-6-12’部分花藥的藥室的花粉母細胞出現異常解離(圖版Ⅱ-B2)，大部分藥室的花粉母細胞能正常發育到四分體時期(圖版Ⅱ-B3)。‘2004-2-30’此時發育正常。

四分體時期，魏可四分體周圍被胼胝質包圍，排列方式是四面體形，小孢子母細胞的分裂方式屬于同時型(圖版Ⅱ-A3)，此時為絨氈層最為活躍時期，藥室內壁徑向壁長于弦向壁，并產生不均勻的與徑向壁平行的條狀增厚，中層解體。大部分‘2004-2-30’藥室在四分體發育正常。

單核早期(圖版Ⅱ-A4)，魏可絨氈層細胞表現切向生長，弦向壁長于徑向壁，細胞之間連接緊密，小孢子核小、壁薄、細胞質較濃、無液泡位于細胞中央。‘2004-6-12’部分藥室絨氈層提前解離，出現多核花粉粒和空殼花粉粒。‘2004-2-30’部分藥室絨氈層已完全消失，出現多核花粉粒，內涵物質外溢相互粘連在花藥中央，同時存在沒有正常解離的四分體小孢子(圖版Ⅱ-C2)。

單核晚期，細胞質中的小液泡聯合成大液泡將細胞核擠到一邊，此時在部分魏可小孢子上有3條清晰可見萌發溝(圖版Ⅱ-A5)。

雙核花粉期，魏可花粉粒積累營養物質，染色較深，此時，絨氈層顯著解體，核消失，內含物消失殆盡，藥室內壁條紋狀增厚明顯(圖版Ⅱ-A5)。‘2004-6-12’、‘2004-2-30’部分小孢子在單核晚期可以正常解離的小孢子進入到雙核花粉期，絨氈層細胞核消失，組織崩潰；小孢子無核，染色淺，表現出高度的液泡化，形成空泡花粉(圖版Ⅱ-B5、C3)。

成熟花粉粒時期，魏可花粉粒形狀一致，染色較深，均勻分布在藥室內，隨后每側的2個藥室之間藥隔消失而連成一體，裂腔裂開散出花粉(圖版Ⅱ-A7)。‘2004-6-12’部分藥室因為絨氈層提早解離致使小孢子發育過程中缺乏營養而喪失活力，小孢子染色淺，且有多數停留在單核小孢子階段，同一藥室內還有少量貌似發育正常，染色較深的花粉粒：藥室內壁能夠正常加厚，花藥也能正常開裂(圖版Ⅱ-B6)。‘2004-2-30’藥腔裂開，發育沒有成熟的花粉粒與畸形花粉相互粘連不能自由散粉(圖版Ⅱ-C4)。

在‘2004-6-12’部分花藥中發現不分化的薄壁細胞團，不形成初生壁細胞和初生造孢細胞，也沒有藥室內壁、中層及絨氈層的分化，沒有小孢子母細胞的形成，不存在小孢子的發生及發育，不具有可育花藥的藥室結構(圖版Ⅱ-B7)。

3 討論

‘2004-6-12’和‘2004-2-30’雄蕊花絲短，花藥反卷，形狀均為近球形，沒有萌發溝，形態特征與賀普超、牛立新等、李鴻莉等對葡萄雄性不育(雌能花)描述一致，屬于典型的葡萄雄性不育(雌能花)類型。‘2004-6-12’和魏可屬于中型花粉粒，‘2004-2-30’屬于大型花粉粒，這可能與倍性不同有關。與魏可相比成熟花粉橫切內含物稀疏、表面光滑，花粉無生活力。依據趙麗梅等㈣(大豆)、姚克敏等(水稻)中育性劃分標準，敗育屬于完全雄性不育(花粉可育度<3％)。

不同植物種類的雄性不育系甚至同一種類的不同雄性不育系敗育的時期和方式都是不同的，且是多種多樣的，在花粉發育的所有階段敗育都有可能發生，敗育機制涉及不止一個。單子葉植物多數在單核至雙核期，雙子葉植物多發生在四分體至小孢子形成期。龍歡等引研究3種甘藍型油菜雄性不育系，因質、核不同，敗育時期也不相同。郭艷玲等㈣研究發現新高梨小孢子敗育主要發生在單核晚期，在小孢子母細胞減數分裂期就表現出部分異常。本研究結果顯示，與新高不同的是‘2004—6-12’和‘2004—2-30’敗育主要發生在單核早期，但是‘2004-6-12’在小孢子母細胞減數分裂期就表現出部分異常。

‘2004-6-12’和‘2004-2-30’敗育主要有以下特點：首先，空粒花粉的形成。多數研究認為，花粉敗育是因為絨氈層異常，即絨氈層細胞在花粉形成和發育過程中過度肥大液泡化、提前或延遲退化。羅來水等舊認為：絨氈層細胞液化解體或增生解體發生在單核花粉晚期到二核期，通常導致空粒花粉的形成；花粉母細胞減數分裂的異常也是造成空粒花粉的因素之一。本研究中絕大多數‘2004-6-12’與‘2004-2-30’花藥中出現的大量空殼花粉粒是由于絨氈層細胞程序化死亡發生紊亂，提前降解，導致大部分小孢子得不到足夠的營養物質造成。李瑩瑩等在辣椒雄性不育系細胞學觀察中觀察到花粉母細胞減數分裂異常導致產生空粒花粉，在部分‘2004-6-12’花藥中觀察到類似現象。其次，小孢子發生異常。‘2004-2-30’成熟花粉粒時期小孢子內含物外溢、相互粘連不能正常散粉。這與王福青等㈣研究的大白菜雄性小孢子的研究有相似之處。第三，‘2004-6-12’部分花粉母細胞分解解體，可能是絨氈層細胞的行為異常而處于饑餓狀態造成。在‘2004-6-12’觀察到為數不多不分化的造飽細胞，它的發生也可能是敗育的原因之一，但其與敗育的關系和機理還待進一步研究。

‘2004-6-12’、‘2004-2-30’部分花藥發育過程中，花藥內壁、中層、絨氈層等都能按照正常途徑生長發育、解體、消失，至花蕾即將開放時，花粉囊中有大量看似發育良好的花粉，但經連續2a進行花粉培養萌發試驗，花粉基本無萌發力，羅來水等對白花重瓣碧桃、臺砂早等的研究中也發現相似情況。有關花粉萌發王臺等_認為：成熟的花粉中積累大量的已合成的mRNA，在花粉萌發時，這些mRNA被翻譯成蛋白質，后者用于花粉的萌發和花粉管的伸長。本實驗對花藥發育的各個時期蛋白質及脯氨酸含量不育種質均低于可育種質，蛋白質水平低下可能是該類花粉不育的原因。據此我們判定‘2004-6-12’和‘2004-2-30’均屬于功能性雄性不育。植物雄性不育是由基因控制的，本試驗的花粉活力是基因表達的結果，因此控制能正常產生花粉的基因可能更為復雜些，與此相關的基因尚有待于進一步研究。

4 結論

‘2004-6-12’和‘2004-2-30’從花器官外部形態、花粉形態、花粉大小、花粉內部結構方面與魏可有顯著差異，花粉沒有活力，屬于典型的葡萄雄性不育種質。果實產量、品質、外觀方面較好，育種和生產利用價值較高。‘2004-6-12’小孢子敗育主要發生在單核早期，但在小孢子母細胞減數分裂期就表現出部分異常；‘2004-2-30’小孢子敗育也主要發生在單核早期。而此前發育正常。說明‘2004-6-12’和‘2004-2-30’小孢子敗育可能與絨氈層提前解體有關。