歐洲李(Prunus domestica)及其近緣種的孢粉學研究

摘 要：運用掃描電子顯微鏡(SEM)系統觀察了李屬(prunus)歐洲李(P.domestica)及其近緣種共13份試材的花粉形態，并采用平均連鎖法(average linkage)對花粉的9個數量性狀和2個質量性狀進行聚類分析。觀察結果顯示，供試歐洲李的花粉均為單粒花粉，中等大小，等極，輻射對稱，極面觀為近圓形或圓形，赤面觀均為橢圓形，表面紋飾由不規則條脊和散落于條脊間的穿孔組成，與其近緣種差異顯著。花粉具3孔溝環狀萌發孔(tri-COlporate)，屬N，P4C，類型，僅在耶魯爾品種觀察到個別花粉具4條萌發溝。對孢粉數量指標進行方差分析，結果表明歐洲李花粉形態與其近緣種存在明顯的差異。聚類分析將供試材料分為二組，即多倍體組和二倍體組，經分析認為野生歐洲李與黑刺李親緣關系近，野生歐洲李可能包含了黑刺李的種質，而栽培歐洲李可能由野生歐洲李演化而來。最后根據花粉形態對李屬供試種的演化進行了討論。孢粉資料結合聚類分析是進行李屬種間親緣關系及演化途徑研究的有效手段。

關鍵詞：歐洲李與近緣種；孢粉學；親緣關系

中圖分類號：S6623 文獻標識碼：A 文章編號：1009—9980f2010104—526—07

花粉的結構是由物種的基因所決定的，不受或受環境影響很小，它和植物的營養器官相比更能反映植物演化上的一般規律。花粉大小、表面紋飾、萌發孔的數目及類型等具有較強的保守性，可以為分類學、系統學和進化關系研究提供重要證據。迄今已在蘋果、梨、桃、杏、葡萄、琵琶等果樹上得到成功應用。

在世界范圍內，李屬植物作為商品李廣泛栽培的包括中國李(Prunus salicina)類型和歐洲李(P如一mestica)，歐洲李因果實形態新穎、風味獨特而倍受人們喜愛，但其起源問題至今頗具爭議。現今涉及李屬植物的孢粉學研究較少，僅限于中國李的個別品種，未見歐洲李花粉形態的研究，我們以廣泛栽培的歐洲李品種、世界上首次發現的野生歐洲李及其近緣種為試材，采用戊二醛固定一臨界點干燥法制樣進行花粉掃描電鏡(SEM)觀察，目的是明確歐洲李及其近緣種的花粉表面紋飾及特征；探討歐洲李的起源及親緣關系，為李種質資源的研究工作提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料來自遼寧省果樹科學研究所國家果樹種質熊岳李杏資源圃。包括歐洲李及其近緣種的試材共計13份。試驗于2009年4—8月在沈陽農業大學儀器測試中心電鏡實驗室進行，憑證樣本現存于熊岳李杏資源圃實驗室。供試材料見表1。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法采集大蕾期即將開放的花朵剝取新鮮花藥，固定于3％的戊二醛固定液中(在真空條件下進行脫氣處理)24h或更長，用0.1mol·L^-1的磷酸緩沖液漂洗3次后經30％、50％、70％、80％、90％、100％的乙醇和醋酸異戊脂梯度脫洗各15min，用液化C02在HCP22型(日立公司，日本)臨界點干燥儀中進行樣品干燥5h，顯微鏡下刺破花藥壁釋放花粉，輕彈于粘有雙面膠的樣品托上，經IB-5離子濺射儀(EIKO公司)噴金處理(噴鍍電流：7～8mA，噴鍍時間：300s)，在S-450掃描電鏡(SEM)(日立公司，日本)下觀測、記錄。選擇有代表性的視野分300x(群體)、2000×(極面觀、赤面觀、萌發孔面)、4000x(萌發孔孔蓋)和5000x(外壁紋飾，即赤道面中央區)進行拍攝(圖版)，照片通過掃描在電腦中觀察，用Calipers 73 pixels軟件進行數量指標測量，每項指標測量數據不少于30個，其中定量指標9個，即極軸長(P)、赤軸長(E)、萌發溝長、萌發溝寬、條脊寬、條脊距、孔徑、孔頻，P／E值；定性指標4個，即赤面觀、極面觀、花粉形狀、外壁紋飾類型。

1.2.2 數據分析數值性狀直接取其數值，無序多態性狀則采用分解法進行編碼閉，將數據標準化，聚類策略采用歐氏距離和平均連鎖法(average link—age)，用SPSSl2.0進行聚類分析。描述術語參照《花粉與孢子術語詞匯表》閉和《孢粉學手冊》。

2 結果與分析

2.1 花粉總體描述

供試材料的花粉均為單粒花粉，等極，輻射對稱，中等大小，極軸長(P)22.98～33.01μm，赤軸長(E)29.17～37.39μm，極面觀為三角形、鈍三角形或圓形，赤面觀為橢圓形或圓形，極赤比處于0.79～0.88，按照Erdtman提出P／E比值確定花粉形狀分，類的方法，李花粉形狀為近扁球形(0.75～0.85)或近球形(0.86～1.14)(表2)。

花粉具三條萌發溝，沿極軸方向等間距環狀分布，赤道中部溝較寬，兩端漸尖；外壁紋飾為平行或彎曲或螺旋狀條脊，穿孔散落與條脊間；萌發孔位于溝的中央或不可見，由溝(colpus)和內孔(eeto—porus)重疊成一個蓋狀結構，稱為孔蓋(endo-aper—ture operculum)，通常獨立于外壁，縱長，橢圓形，覆有不規則的擬網狀(reticulate-Iike)紋飾，屬ErdtmanNPC系統中的№P4C，類型，即3孔溝環狀萌發孔(tri-colporate)(表3)。

2.2 花粉形態特征

2.2.1 歐洲李(p.domestica) 花粉粒三孔溝，偶有四孔溝花粉(圖版—2)。極軸長26.06～36.96μm，赤軸長30.00～39.13μm，P／E為0.85～0.88，近球形或球形(圖版—3)，極面觀為圓形(圖版—1.2)，赤面觀近圓形或圓形：栽培歐洲李條脊排列不規則，螺旋狀并且分叉，向不同方向延伸，條脊間有少量穿孔(圖版一5～8)，內孔不可見，溝緣整齊，萌發溝狹窄(圖版—3.4)；野生歐洲李花粉外壁條脊呈二崎分支狀，基本延兩極方向延伸，但條脊寬窄差異明顯，穿孔密度大(圖版10)，內孔稍外凸，長橢圓形，縱長，覆不規則網狀紋飾。

2.2.2 黑刺李(P.spinosa)花粉粒三孔溝，極軸長27.14～28.57μm，赤軸長34.06～38.41μm，P／E為0.84，扁球形，極面觀圓形(圖版—11)，赤面觀為橢圓-形，外壁條脊短且彎曲分叉，寬窄不均，向兩極方向延伸，穿孔密度大(圖版13)，內孔孔蓋外凸，長橢圓-形，縱長，覆不規則網狀紋飾(圖版12)。

2.2.3 櫻桃李(P.cerasifera) 花粉粒三孔溝，極軸長25.00～28.87／μm，赤軸長26.46～33.80μm，P／E為0.85～0.87，近球形或球形，極面觀為鈍三角形(圖版—14)，赤面觀橢圓形，外壁條脊平行排列或稍有彎-曲，條脊間密布穿孔(圖版16)，內孔孔蓋外凸，縱-長，長橢圓形，覆不規則網狀紋飾(圖版15)。

2.2.4 中國李(P salicina) 花粉粒三孔溝，極軸長22.86～27.35μm，赤軸長2686～32.99μm，P／E為0.79～0.84，扁球形，極面觀為三角形(圖版—17.18)，赤面觀橢圓形，外壁具條脊窄且平行排列。脊洼較淺(圖版20)；內孔孔蓋外凸或稍外凸，長橢圓形，縱-長，覆不規則網狀紋飾(圖版—19)。

2.3 花粉形態指標的建立

對供試材料花粉的9個數量指標分別運用方差分析進行差異顯著性檢驗(表4)，結果表明，除花粉萌發溝長外各指標在供試的李屬種間均有顯著性差異，其中花粉大小(極軸長、赤軸長)、形狀(P／E)、條脊寬和穿孔密度在種間的差異更為顯著，因此，除萌發溝長外的8個性狀作為掃描電鏡下李屬花粉形態描述和種間鑒定的量化指標，而極軸長、赤軸長、P／E、條脊寬、穿孔密度以及表面紋飾特征為重要指標。

2.4 聚類分析

根據9個定量指標，即極軸長(P)、赤軸長(E)、萌發溝長、萌發溝寬、條脊寬、條脊距、孔徑、孔頻、P／E值及編碼后的4個定性指標，即赤面觀、極面觀、花粉形狀、外壁紋飾類型進行聚類分析。聚類結果顯示(圖1)。將聚類水平確定在歐氏距離為12的水平上，據此供試的13份李種質分成二組，即多倍體組(I)和二倍體組(Ⅱ)，前者由六倍體歐洲李和四倍體黑刺李組成，后者包括二倍體中國李和櫻桃李；歐氏距離為8時，第1組又由栽培歐洲李亞組和野生歐洲李亞組組成。

3 討論

3.1 歐洲李的起源

歐洲李的起源一直是懸而未決的問題。現有的學術觀點大致可分為4種，其中較普遍的是Crane等的假說㈤，即歐洲李起源于小亞細亞，是二倍體櫻桃李和四倍體黑刺李的天然雜交種，此觀點先后得到形態標記、分子標記(RAPD)等方面證據的支持。而林培鈞在新疆考察時發現了櫻桃李分布群，這與起源于歐洲的黑刺李相隔千里并有高山阻隔，故認為歐洲李是二倍體櫻桃李和四倍體黑刺李的天然雜交種的說法得不到證實。同樣是RAPD分子標記，劉三軍等結果并不能確認Crane和Lawrence的假說，并推測歐洲李可能由黑刺李演化而來，而黑刺李帶有櫻桃李和其他李的種質。也有學者_吲認為歐洲李是起源于櫻桃李的同源多倍體。

本試驗聚類結果顯示：櫻桃李和黑刺李分聚二倍體組和多倍體組，并未聚在一起，由此本文認為從孢粉學上不支持歐洲李是櫻桃李和黑刺李是天然雜交種的觀點。另外，栽培歐洲李、野生歐洲李和黑刺李均聚在多倍體組中，該組由栽培歐洲李亞組和野生歐洲李亞組組成，其中黑刺李與野生歐洲李緊密聚類，原因是2者在花粉形態上極為相似，表現為外壁條脊短且首尾收縮成梭形，寬窄不均、相互交織，向兩極方向延伸，并有大量穿孑L散布在條脊間。而在植物學性狀上，2者葉片小而厚，果實均卯圓形，果皮紫黑，口感酸澀，故筆者認為黑刺李和野生歐洲李親緣關系近，結合物種由低倍體向高倍體進化的趨勢，認為野生歐洲李較黑刺李更進化，并且野生歐洲李包含了黑刺李的種質；此外，在聚類圖中，野生歐洲李與栽培歐洲李優先聚類，2者在花粉形態方面的過渡性相似，即花粉極面觀為圓形或近圓形，外壁條脊寬且彎曲、排列不規則等，加之2者同屬六倍體物種這一特性，說明歐洲李是在野生歐洲李的基礎上演化而來，同時融入了黑刺李的種質。

試驗發現歐洲李(2n=6x=48)的外壁條脊在相同放大倍數下有相對較粗和較細之分，甚至在同一品種內有此現象，具細條脊的花粉其條脊的螺旋程度及排列的不規則程度高于粗條脊花粉，可能的原因有二：第一，這與減數分裂異常和減數分裂不規則有關，在小孢子發生中可能發生非等倍的配子體，減數分裂紊亂主要是由于細胞融合的結果所導致的，紊亂程度因品種而異；第二，這種差異可能是在花粉形成過程中控制花粉紋飾的遺傳物質發生變異所致，并與所處的生態環境有關。

3.2 李屬供試種的演化

Walker認為外壁紋飾可作為衡量被子植物進化程度的參考指標之一，植物的進化反映在花粉粒由小到大的演化過程中；外壁紋飾由規則向不規則、簡單向復雜進化，且條脊及條脊距較寬為進化的特征；王業遴等根據對核果類果樹花粉形態的鑒定得出結論：條脊相互交織是復雜紋飾，是進化的表現；張秀英等對同為薔薇科的桃(Prunus persica)的花粉進行掃描電鏡觀察后發現條脊由平滑向脊洼深進化。本文供試試材中，中國李的花粉外壁，條脊細且平行排列，脊洼較淺，無或有少量穿孔分布。紋飾簡單，為原始類型；而櫻桃李的花粉，在平行排列的條脊間分布大量穿孔，是較中國李進化的類型：歐洲李花粉的表面紋飾復雜，由螺旋狀的不規則寬條脊及穿孔組成，條脊向不同方向延伸，分叉并相互交織，且花粉大小及條脊寬度明顯大于其近緣種，為最進化類型；而黑刺李和野生歐洲李的花粉外壁則以基本向兩極方向延伸的條脊和散生與條脊間的大量穿孔為紋飾特征，條脊短而彎曲分叉，寬窄不均，復雜程度介于櫻桃李和歐洲李之間，是較進化類型。所以供試李屬種可能的進化順序是：中國李一櫻桃李一黑刺李一野生歐洲李一歐洲李。