液相色譜三級四極桿質譜法快速測定動物組織中維吉霉素M1殘留量

陳小霞,岳振峰,葉衛翔,趙鳳娟,饒麗,葛麗雅,歐陽姍

1(深圳大學教務處,廣東深圳,518060) 2(深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心,廣東深圳,518067)

維吉霉素 (Virginiamycin),別名維吉尼亞霉素、維吉尼霉素、肥大霉素等。維吉霉素是美國史克藥廠畜禽保健公司對鏈球菌發酵提取的抗生素。它由70%大環內酯 (M1)(圖 1)和 30%環狀多肽 (S1)(圖2)混合組成。兩者結構不同,抗菌范圍也不同。維吉霉素的作用主要是抑制細菌的核糖體(Ribosome),從而阻止細菌蛋白質的合成而達到殺菌效果。維吉霉素可用于防治畜禽細菌性痢疾和雞壞死性腸炎,改善飼料的利用率,促進畜禽的生長,已被廣泛使用。但這類藥物也存在一定的副作用,存在著潛在的食品安全風險。中國、美國、日本均規定了動物組織中維吉霉素的最高殘留限量,其中以日本的限量規定最為全面和嚴格;歐盟則禁止維吉霉素作為飼料添加藥物使用。維吉霉素在動物組織中主要以原形藥物狀態存在。目前各國法規中沒有明確規定維吉霉素的殘留標識物,但由于 M1為主要成分,國內外普遍將維吉霉素M1作為維吉霉素的殘留標識物。

目前國內外關于動物源性食品中維吉霉素藥物殘留的檢測方法研究報道均較少[1-13],方法包括瓊脂擴散法[1]、酶聯免疫法[2]、薄層色譜法與生物自顯影聯用法[3-4]、高效液相色譜法[5-10]和液質聯用法[11-13],其中 GB/T 20765—2006規定了豬肝臟、腎臟、肌肉組織中維吉尼霉素M1殘留量的測定方法,但該方法的線性范圍未包括國內外的限量規定濃度,而且需要繁瑣的固相萃取步驟,效率低下。本文采用乙腈脫蛋白同時提取目標物,水稀釋,再利用液質聯用法的選擇性較高和抗干擾能力較強的特點,實現了動物組織樣品中維吉霉素殘留的快速測定和確證。

圖 1 維吉霉素M1的分子結構

圖 2 維吉霉素 S1的分子結構

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

API3000型三級四極桿質譜儀 (美國應用生物系統公司),配電噴霧離子源和 Agilent 1100型液相色譜儀;MinishakerMS1型漩渦混合器 (美國 IKA公司);PT3000型均質器 (德國 Brinkmann公司);Turbo LV型吹氮濃縮儀 (美國 Zymark公司);Universal 32型低溫離心機 (德國 Hettich公司);KQ-50B型超聲清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)等。

維吉霉素M1(Sigma公司,純度約 95%);乙腈和甲酸均為色譜純試劑;其他均為分析純試劑;水為超純水。

雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎等動物組織樣品均為市購。

1.2 樣品處理

稱取試樣 1 g(精確到 0.01 g),置于 15 mL具塞聚丙烯離心管中,加入 3 mL乙腈,旋渦混合 1 min,冰水浴超聲提取 5min。以 3 000 r/min的轉速在 15℃下離心 5 min,收集上清液于具有刻度的離心管中。離心后的殘渣用 2 mL乙腈重復上述提取步驟 1次,合并上清液,用水稀釋定容至 10mL,混勻。加入 4mL正己烷,混合 1min,3 000 r/min 5-15℃離心 5 min,棄去正己烷層,下層溶液過 0.22 μm濾膜后供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.3 色譜質譜條件

Y MC-Pack Pro C18色譜柱 (3μm,100 mm ×2.0 mm i.d.);流速:0.3 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。流動相為乙腈和 0.003 mol/L甲酸銨緩沖液,洗脫梯度:乙腈的比例在 1.0min內由 30%線性提高到70%,保持 4.0min,柱平衡時間 5 min。

ESI+離子化模式;質譜分辨率:單位質量分辨率;監測模式:多反應監測 (MRM);霧化氣:5.0 L/min;氣簾氣:12.0 L/min;噴霧電壓:4.5 kV;去簇電壓 (DP):50 V;聚焦電壓 (FP):270 V;射人電壓(EP):10 V;去溶劑溫度:550℃;去溶劑氣流:7.0 L/min;碰撞氣 N2:6.0 L/min。其他條件見表 1。

表 1 維吉霉素M1的保留時間和優化質譜條件(帶“＊”號者為定量離子)

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

首先采用 10 mg/L的待測化合物的標準溶液以流動注射的方式在正離子模式下進行全掃描,確定分子離子,然后以待測化合物的分子離子為母離子,進行子離子掃描。選取豐度較強、干擾較小的 2個子離子為定性離子。最后以多反應監測 (MRM)正離子模式優化去簇電壓 (DP)、聚焦電壓 (FP)、射人電壓(EP)、碰撞能量 (CE)、碰撞室射出電壓 (CXP)、霧化氣 (NEB)、氣簾氣 (CUR)、碰撞氣 (CAD)、噴霧電壓(IS)、離子化溫度 (TEM)等各種質譜參數,得到最佳質譜條件 (表 1)。

2.2 色譜條件的優化

因維吉霉素M1分子結構中有多個氨基和羥基,能在水中發生解離,色譜柱固定相表面的殘存硅醇基和金屬離子可通過氫鍵或離子交換作用對其產生強烈吸附作用,出現色譜峰拖尾、保留時間不穩定或過長,甚至被保留在色譜柱上,導致峰形異常和分離度下降。本研究采用以高純硅膠為基體并經端基封閉處理的 Y MC-Pack Pro C18柱進行了分離試驗,發現該柱對維吉霉素和干擾成分具有良好的分離效果和對稱的峰形,可滿足質譜檢測的要求。

國家標準 G B/T 20765—2006采用甲醇 +乙腈 (50+50)與 0.003mol/L甲酸銨緩沖液作為流動相,需要 35 min才能完成檢測。本方法用乙腈代替甲醇 +乙腈(50+50),通過梯度優化,可將檢測時間縮短到 10min,大幅提高了檢測效率,而且峰形尖銳對稱 (圖 3)。

圖 3 加標雞肉樣品中維吉霉素M1的多反應監測(MRM)色譜圖 (加標濃度 25μg/kg)

2.3 提取和凈化條件的選擇

文獻報道的提取溶劑主要有:甲醇 +磷酸氫二銨[5]、甲醇[6]、甲醇 +乙腈[7,12]、乙酸乙酯[9,11]、乙腈[13]等,本方法經比較試驗發現,直接采用乙腈超聲提取不僅可以減少脂肪等雜質的提出,而且回收率較高。文獻報道的凈化方法包括 C18固相萃取凈化[1-3]、硅膠 +HLB固相萃取凈化[4]等。本文經研究發現,樣品提取液經水稀釋后用正己烷凈化,即可達到凈化要求,不僅避免了煩瑣的固相萃取凈化步驟,而且降低了檢測成本,提高了檢測效率。

2.4 樣品基質效應的考察

大氣壓噴霧電離離子源 (ESI)容易受樣品基質的影響,但通過試驗發現,基質匹配標準溶液與純溶劑標準溶液的響應值不存在顯著差異,因此維吉霉素M1不存在樣品基質效應或樣品基質效應不顯著。

2.5 方法的線性關系和定量低限

在本檢驗方法所確定的實驗條件下,取一系列標準溶液,以峰面積 (Y軸)對相應的維吉霉素M1的濃度 (X軸)作圖,結果表明,標準溶液的濃度與對應的峰面積在 2-50μg/L內呈現良好的線性關系,線性方程為Y=2.96×103x+2.27×103,線性相關系數為0.999 5。經實驗室內驗證試驗,確定本方法的定量低限為:雞肉 25μg/kg、雞肝 100μg/kg、雞腎 100μg/kg、牛腎 100μg/kg、豬腎150μg/kg。

2.6 方法的回收率與精密度

以不含維吉霉素M1殘留的動物組織為空白樣品基質,綜合考慮中國、美國、日本以及中國香港的最大殘留限量規定,按照表 2進行 3個濃度水平進行添加回收試驗,每個濃度水平進行 10次重復試驗,測得維吉霉素的回收率和精密度匯總于表 3。本方法的回收率范圍為:雞肉 86.8%-108%、雞肝 81.8%-109%、雞腎 85.5%-102%、豬腎 82.7%-102%、牛腎 80.7%-103%,實驗室內相對標準偏差為:雞肉4.3% -6.7%、雞肝 3.3%-7.3%、雞腎 2.8%-4.6%、豬腎 1.9%-4.1%、牛腎 3.4%-6.9%,符合國內外對殘留分析的要求。

表 2 不同樣品基質中維吉霉素M1的添加水平 μg/kg

2.7 實際樣品分析

應用本方法分別檢測雞肉、雞肝、雞腎、豬腎和牛腎樣品各 20批,檢測結果統計情況匯總于表 4?？梢?除豬腎和雞肉樣品各檢出 1例不合格樣品外,其他樣品均合格。該方法具有靈敏高、選擇性強、簡便、快速等優點,方法的各項性能指標滿足國內外食品安全法規的要求,可用于動物組織樣品中維吉霉素M1殘留的快速確證檢測。

表 4 動物組織樣品中維吉霉素M1殘留的實際樣品檢測情況匯總表

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