結核分枝桿菌Rv2352c基因的克隆表達及其抗原活性鑒定

曹廷明 賈紅彥 古淑香 鄭曉靜 李自慧 杜鳳嬌 劉洋 劉忠泉 邢愛英 杜博平 馬玙 張宗德

(北京市結核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

結核病是單一致病菌引起成年人死亡的主要原因,據世界衛生組織估計每年全球約有900萬新發病例,300萬人死亡,死亡人數居單一傳染病之首[1]。缺乏針對結核病的早期、快速、靈敏、特異的診斷技術仍然困擾著結核病防控工作。目前,結核病的診斷在診斷標志物和診斷技術等方面還存在很多空白。隨著現代分子生物學特別是生物信息學、基因組學、蛋白質組學的快速發展,為開發新的結核病診斷標志物和診斷技術提供了可能和極大的便利。結核分枝桿菌Rv2352c基因是本課題組利用生物信息學和比較基因組學等方法篩選出來的特異性基因之一。2008年9月本研究構建了Rv2352c基因的高效原核表達載體,表達獲得目的蛋白,并對Rv2352c蛋白的抗原性進行了研究,旨在為結核病的診斷和防治的靶抗原篩選奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 菌株與質粒 質粒p GEM?-T Easy購自p romega公司、p ET30a(+)由病毒所李琳琳博士惠贈。宿主菌DH5α、BL21(DE3)購自北京鼎國生物公司。結核分枝桿菌標準株(H37Rv)為本研究室保存。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、His-tag Antibody、DNA及蛋白質分子量標準購自北京天根時代生物公司。Amp、Kan、IPTG及尿素購自北京鼎國生物公司。限制性內切酶Bam H I、Xho I及 T4 DNA連接酶購自NEB公司。膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均由Q IA GEN生物工程公司提供。硝酸纖德維素膜(NC)、HRP標記的羊抗兔 IgG、HRP標記的羊抗小鼠 IgG、HRP標記的羊抗人 IgG、IgM、IgA及DAB顯色試劑,購自武漢博士德公司。Ni-N TA蛋白純化樹脂購自 Novagen公司。蛋白定量試劑盒購于普利萊基因技術有限公司。

1.3 引物設計 根據 Genebank公布的結核分枝桿菌Rv2352c全基因序列設計如下引物,上游:5′-CGGGA TCCGGTGGTGGTA TGA TTTTGGA TTTTTCGTGG-3′,含 Bam H I酶切位點 ;下游 :5′-CCGCTCGA GTCCGA TCCCGACCCGCGG-3′, 含Xho I酶切位點。相關引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.4 Rv2352c基因的擴增及產物的純化 以結核分枝桿菌 H37Rv菌株的基因組DNA為模板,采用PCR方法擴增得到 Rv2352c基因片段。100 ul PCR反應體系中加入:2 ul模板,6 ul dN TP(各2.5mmol/L),10 ul Buffer(10X),1 ul上游引物,1 ul下游引物,0.5 ul(5 unit/ul)聚合酶,79.5 ul ddH2O;PCR反應條件:95℃5 min,94℃45S,60℃45S,72℃2m in,72℃10m in,反應循環數為30。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并以瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化,操作方法按照產品說明書進行。

1.5 重組表達載體p ET30a(+):rv2352c的構建及鑒定 將目的基因的 PCR產物和表達載體(p ET30a)用限制性內切酶Bam H I和 Xho I分別進行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳法回收純化含粘性末端的rv2352c DNA片段及p ET30a(+)5 500 bp的大片段酶切產物,構建p ET30a(+):rv2352c重組體;轉化DH 5α感受態細胞,用含30mg/L Kan的LB固體培養基篩選重組子。對挑取的重組載體進行Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,得到有正確插入片段的克隆,隨后對雙酶切驗證正確的克隆進行測序,測序檢驗正確后,將陽性重組載體轉化大腸桿菌BL 21(DE3)。

1.6 重組質粒的誘導表達及表達形式 挑取含重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)單菌落,并接種2m l LB培養基中,37℃過夜培養,隨后以1∶50的比例將過夜培養菌重新接種于LB培養基中,37℃培養至OD600=0.6～0.8左右時,用終濃度為0.8mM的IPTG進行誘導,37℃,200轉/min培養3 h,隨后收集菌體,將收集的菌體沉淀用30～100μl 10 mM Tris-HCl(p H 8.0)緩沖液吹散(加入緩沖液的量視菌體量而定),加入與緩沖液等體積的2×溴酚藍Buffer,100℃煮5 m in,進行 SDS-PA GE電泳檢測。另取100μl超聲(500W,30次,每次10 s,間隔15 s)后的菌懸液,13 000轉/m in,離心10m in,取50 μl上清至另一 EP管,加 50μl 2×溴酚藍Buffer,100℃煮5 min,電泳,上清去除干凈后沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液吹散,加入50μl 2×溴酚藍Buffer,100℃煮5 m in,SDS-PA GE電泳。

1.7 目的蛋白的純化及鑒定 挑選有表達的克隆,接1～2μl活化的菌液到250m l LB液體培養基中,37℃,200轉/min,過夜培養。第2 d取過夜培養的250 m l菌液與等體積LB液體培養基混合,37℃,200轉/min,培養至 OD=0.6～0.8,IPTG誘導(125μl(0.8M)IPTG/250 m l菌液),2.5 h后收菌。大量收菌:用400 m l大離心筒,6 000轉/min,離心5m in。棄上清。超聲破菌:沉淀用20～30 m l 10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液吹散,超聲。收集超聲離心后上清和沉淀。Ni柱純化:用純水洗柱,至p H 7.0。掛鎳,至p H 2～3。純水洗柱至p H 7.0。10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約 100 m l。含0.5M氯化鈉的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約50 m l。含8M尿素,0.5M氯化鈉的10mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液平衡鎳柱,約50 m l。稀釋樣品(沉淀)上樣。樣品需要事先加入氯化鈉,終濃度為0.5M。上樣結束后,用含8M尿素,0.5M氯化鈉的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)溶液洗柱。分別用含15mM咪唑、60mM咪唑、500mM咪唑的10 mM Tris-HCl(p H 8.0)(含8M尿素、0.5M氯化鈉的)溶液洗脫,分別收集蛋白峰。SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化效果。

1.8 目的蛋白的抗原性鑒定 采用Western blot法:將重組蛋白進行SDS-PA GE,隨后以100 m A穩流電轉1.5 h,將凝膠上的蛋白質轉印到 PVDF膜上,用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h,PBST洗膜3次,每次5min。將PVDF膜浸于1∶100稀釋的結核病人血清中室溫孵育2 h,洗膜3次后,再與1∶2 500的 HRP標記的羊抗人 IgG室溫反應1 h,洗膜同上。最后,將PVDF膜浸入DAB顯色液中染色,以蒸餾水沖洗終止反應。

1.9 Rv2352c的多克隆抗體的制備及鑒定 取體質量2～3 kg的2只新西蘭白兔,皮下初次免疫免疫劑量為200 ug蛋白/只,2周后再進行連續3次加強免疫,加強免疫的時間間隔為1周,加強免疫的劑量為為200μg蛋白/只。最后1次加強免疫兩周之后,耳靜脈取血,采用間接 ELSIA法進行效價測定,隨后頸動脈取血,離心收集多抗血清,共收集60m l,即Rv2352c蛋白相應的兔抗血清。將獲得的抗血清用結合緩沖液(100 mmol/L Tris-HCL,p H 7.5 100mmol/L NaCl)稀釋后,經過0.45μm的濾膜過濾,加樣到IgG親和層析柱中,用洗脫緩沖液(100 mmol/L甘氨酸-HCL,p H 2.5)洗脫后,收集洗脫峰。以本課題組前面制備的 Rv2352c蛋白作為抗原,進行 Western blo t檢測,一抗為 1∶2 000稀釋的Rv2352c多克隆抗體,二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG,ECL法(增強化學發光法)檢測。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌rv2352c基因的擴增及表達載體的構建 在Genebank數據庫中獲得結核分枝桿菌rv2352c基因序列,以PCR方法擴增1 176 bp大小的rv2352c基因產物(圖1)。

圖1 rv2352c基因的PCR產物

將獲得的構建p ET30a(+):rv2352c陽性重組體用限制性內切酶Bam HⅠ和XhoⅠ分別進行雙酶切,雙酶切圖譜顯示其中的一個片段大小與目的基因相似(圖2)。對雙酶切驗證正確的陽性克隆進行測序,測序結果證實p ET30a(+):rv2352c構建成功。

圖2 p ET30a(+):rv2352c的酶切鑒定

2.2 重組蛋白 Rv2352c在大腸桿菌BL 21(DE3)中的表達和純化 將陽性重組載體p ET30a(+):rv2352c轉化大腸桿菌BL 21(DE3),挑選有表達的克隆并進一步培養,制備培養菌的蛋白提取物,并分為上清液和沉淀物 2個部分。進一步的 SDSPAGE電泳結果顯示,rv2352c重組表達蛋白主要在沉淀物中(圖3),說明表達的重組蛋白以不溶性包涵體形式存在于胞質中。

圖3 重組蛋白在BL21(DE3)菌中表達的SDS-PAGE鑒定

用Ni柱純化重組蛋白的提取物,收集純化產物,隨后的SDS-PA GE電泳結果顯示已經獲得較高純度的重組蛋白Rv2352c(圖4)。

圖4 Ni柱純化重組蛋白收集物純度的SDS-PAGE電泳鑒定

2.3 重組蛋白 Rv2352c的抗原性鑒定 重組蛋白Rv2352c可與結核病人血清在大約45 kD處,產生特異性免疫反應條帶(圖5)。提示該蛋白具有抗原性,在其宿主人體內很可能存在相對應的抗體。

2.4 重組蛋白 Rv2352c抗血清的效價測定及其多克隆抗體特異性鑒定 采用間接 ELSIA法對重組蛋白Rv2352c抗血清的效價進行測定,測定結果表明獲得了高效價的抗 Rv2352c多克隆抗體,兔抗血清的滴度高達1∶25 600(圖6)。

圖5 Rv2352c與結核病人血清進行蛋白免疫印記分析

圖6 Rv2352c的免抗血清的效價測定

將重組蛋白 Rv2352c抗血清用 IgG親和層析柱進行純化,獲得重組蛋白Rv2352c的純化多克隆抗體,隨后進行Western blot的檢測結果證實此多克隆抗體能夠與重組蛋白Rv2352c進行免疫反應,條帶位置與純化的Rv2352c重組蛋白一致,說明此抗體能夠特異性的與 Rv2352c重組蛋白發生免疫反應,可能能夠用于檢測結核分枝桿菌中的Rv2352c蛋白(圖 7)。

3 討論

近年來,由于多重原因造成結核病重新流行,再次成為嚴重的公共健康問題;特別是艾滋病和結核病的合并感染以及耐藥結核病感染者持續增多,使得這一形勢更加惡化,給結核病的防治帶來新的挑戰[2],結核病的基礎和臨床越來越受到世界各國的重視。長期以來,由于缺乏快速、敏感的結核病診斷技術和方法,使得難以及時篩選出結核病的潛伏感染病例和早期病例,造成結核病人漏診、診斷時間延長或誤診,使結核病不斷傳播。現有的診斷方法不能滿足結核病預防、控制的需要,因此迫切需要開發研制出新型快速、靈敏、特異的結核病診斷方法和技術。

圖7 Rv2352c與其多抗的Western blot

經過長期的演化,結核分枝桿菌已進化為非常成功的一種致病菌。結核分枝桿菌通過呼吸道進入人體后,侵入肺泡的結核分枝桿菌被吞噬細胞吞噬,結核分枝桿菌主要寄生于巨噬細胞內,并通過其逃逸機制逃避免疫殺傷,在巨噬細胞內長期存活而造成持留(persist)[3]。結核分枝桿菌從進入宿主細胞,直至宿主發病的過程中,激發了宿主機體的強免疫反應,同時其通過調節宿主的免疫系統的平衡,使之更加適合于其在宿主體內寄生,導致宿主發病,甚至導致宿主死亡。為了準確的診斷結核病,除了檢測結核分枝桿菌所導致的明顯肺部病變特征外,另外主要還是靠實驗室診斷來檢測宿主體內是否存在結核分枝桿菌以及其所激發的免疫反應特征,并最終確診宿主是否患了結核病及患病程度。結核病的實驗室診斷目前除抗酸桿菌涂片法、結核菌培養法外,應用較多的是利用核酸探針雜交和PCR擴增等技術對結核分枝桿菌特異性DNA序列進行檢測,利用抗原-抗體反應對結核分枝桿菌特異性蛋白質和多肽進行檢測,EL ISPO T診斷技術、全血 IFNγ檢測方法和其他細胞因子檢測方法等[4],新的檢測結核的診斷方法和技術還在不斷的涌現[5],但仍然缺乏快速、準確的結核病診斷方法[6]。目前作為被檢目標的結核菌特異性抗原主要有脂阿拉伯甘露糖抗 原[7]、38 kD[8]、ESA T6[9],CFP10,M PT64,PstsS1,Ag85B,rpoB,M r90等,但基于這些特異性抗原的診斷方法的靈敏度、特異性仍然不能夠達到理想的要求,結核病診斷方法和技術的敏感性和特異性均直接取決于目標分子的特異性,目標分子特異性的高低直接影響結核檢測結果的可靠性和準確性。篩選和鑒定新的特異性的目標分子作為診斷結核病的標靶仍是開發新的診斷技術的關鍵。

結核分枝桿菌Rv2352c基因是本課題組利用生物信息學和比較基因組學等方法篩選出來的特異性基因之一。目前對 Rv2352c基因進行的研究報道還很少。本實驗構建了 Rv2352c的原核表達質粒。所用質粒PET30 a(+)是一種融合型蛋白的表達載體,通過在編碼的外源蛋白的N端構建6個組氨酸殘基,利用Ni-N TA樹脂可方便地將外源蛋白從菌體蛋白中純化出來。SDS-PA GE電泳分析發現,在45 kD左右出現一條明顯的蛋白條帶且與目標蛋白的分子量大小一致,即為Rv2352c蛋白。將目的蛋白純化后免疫新西蘭大白兔,能夠激發新西蘭大白兔產生高滴度的抗體反應,收集兔抗結核分枝桿菌Rv2352c抗血清,并通過親和層析法純化獲得對應的多克隆抗體;對Rv2352c重組蛋白進行免疫印記分析,結果顯示此重組蛋白不僅能夠與結核病人的血清發生免疫反應,同時也能夠與其兔抗血清發生免疫反應,這說明Rv2352c蛋白既有較好的免疫反應性也有很好的免疫原性。

本研究成功地構建了原核表達載體p ET30a(+):Rv2352c,并獲得了純化的 Rv2352c重組蛋白,同時還獲得了該重組蛋白對應的多克隆抗體,并證實Rv2352c蛋白既有較好的免疫反應性也有很好的免疫原性。這為進一步篩選結核病的診斷和防治的靶抗原奠定了基礎。

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