人端粒酶催化亞單位(hTERT)反義分子探針的制備與理化性質(zhì)初步研究

王榮福，劉 萌，張春麗，閆 平

北京大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100034

反義顯像是將放射性核素標(biāo)記的一段人工合成的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASON)引入體內(nèi)后，根據(jù)“堿基互補(bǔ)配對原則”，追蹤其與病變組織中過度表達(dá)的目標(biāo)DNA或mRNA發(fā)生特異性結(jié)合的過程，從而達(dá)到在基因水平上早期、特異、定量診斷疾病的目的[1-2]。大量研究證實(shí)，人端粒酶催化亞單位(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是迄今所知的人體腫瘤特異性最強(qiáng)的生物標(biāo)志之一[3-4]，具有腫瘤特異診斷和治療的潛在應(yīng)用價(jià)值。基于以上認(rèn)識，本研究提出以hTERT為生物靶點(diǎn)，制備一種新型的反義分子探針，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行初步研究。

選擇合適的放射性核素和適宜的標(biāo)記方法是成功進(jìn)行反義顯像的關(guān)鍵問題。在所應(yīng)用的臨床顯像藥物中，放射性核素99Tcm及其標(biāo)記的化合物約占總量的80%。99Tcm物理性能優(yōu)良，為純γ光子發(fā)射體；能量適宜，為140 keV；半衰期(T1/2)合適，為6.02 h；獲取方便，可通過99Mo-99Tcm發(fā)生器產(chǎn)生；價(jià)格較為便宜；廣泛應(yīng)用于臨床核醫(yī)學(xué)多種臟器的顯像診斷。因此，本研究擬選取放射性核素99Tcm標(biāo)記針對hTERT mRNA的ASON，通過標(biāo)記條件優(yōu)化，制備反義分子探針。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑、材料及儀器

根據(jù)ASON的設(shè)計(jì)原則以及文獻(xiàn)報(bào)道[5]，針對hTERT mRNA的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASON)序列為5′-TAGAGACGTGGCTCTTGA-3′，正義寡核苷酸(sense oligonucleotide,SON)序列為5′-TCAAGAGCCACGTCTCTA-3′，每條鏈均為全硫代修飾，3′端連接一個(gè)伯氨結(jié)構(gòu)，修飾結(jié)構(gòu)式為5′-ASON-(CH2)6-NH2-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。雙功能螯合劑S-Acetyl NHS-MAG3由美國Hnatowich D J博士贈送。SephadexG25(Fine)，瑞典Amersham公司。SnCl2·2H2O，美國Sigma公司。99Tcm洗脫液，中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所。

SMA3000-UV-VIS型微量分光光度計(jì)，北京華大基因研究中心。真空離心干燥儀，美國LABCONCO公司。RM905型放射性活度儀，中國計(jì)量科學(xué)研究院。FT-163型放射免疫測量儀，國營二六一廠。AlphaImagerTM2200凝膠成像儀，美國Alpha Innotech公司。

1.2 ASON與NHS-MAG3的偶聯(lián)反應(yīng)

[6-7]報(bào)道，取5 OD ASON(OD即為吸光度值)，以HEPES緩沖液(0.1 mol/L，pH=8.0)溶解，質(zhì)量濃度5 g/L。在振蕩條件下，將新鮮配制的NHS-MAG3溶液加入ASON溶液中，使二者的最終摩爾比(MAG3/ASON)達(dá)到20∶1。室溫下，靜置反應(yīng)60～120 min。反應(yīng)產(chǎn)物通過Sephadex G25層析柱(0.7 cm×28 cm)純化。洗脫液為PB緩沖液(50 mmol/L，pH=7.2)；洗脫產(chǎn)物按照每管0.4 mL收集。紫外分光光度計(jì)測定每管洗脫產(chǎn)物在260 nm處的波長吸收情況(OD260 nm)，計(jì)算產(chǎn)物含量(1 OD≈30 μg)。合并高峰管(OD260 nm值以及放射性活度值均最高的管)，以每管10 μg分裝。真空離心干燥后，-20 ℃條件下保存、備用。質(zhì)譜分析MAG3-ASON，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部醫(yī)藥衛(wèi)生分析中心協(xié)助完成。

1.3 MAG3-ASON的放射性核素99Tcm標(biāo)記

1.4 99Tcm-hTERT ASON的標(biāo)記穩(wěn)定性分析

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON溶液，分別放置在以下條件：① 原液(室溫)；② 加10倍體積的生理鹽水(37 ℃)；③ 加10倍體積的人新鮮血清(37 ℃)，孵育不同時(shí)間(0、1、2、4、6、8、24 h)后，分別取樣，紙層析法測定99Tcm-hTERT ASON的放射化學(xué)純度。

1.5 99Tcm-hTERT ASON的序列穩(wěn)定性分析

取1 μg的99Tcm-hTERT ASON，溶于正常人新鮮血清中；在37 ℃條件下孵育不同時(shí)間(1、2、4、6 h)后，分別采用酚/氯仿法[8]從人新鮮血清中提取99Tcm-hTERT ASON；取樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)檢測。以未經(jīng)血清37 ℃孵育的99Tcm-hTERT ASON作為對照組。

1.6 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白結(jié)合率

取100 μL的99Tcm-hTERT ASON，與人新鮮血清(100 μL)在37 ℃水育箱中孵育不同時(shí)間(1、3、6 h)。其后采用酚/氯仿法沉淀血清蛋白，即：加入酚/氯仿溶液(體積比為1∶1)，充分混勻5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液；將沉淀物重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)1遍；分別收集上清液和沉淀物，γ放射免疫計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(C)。根據(jù)公式計(jì)算：血清蛋白結(jié)合率=100%C沉淀物/(C上清液+C沉淀物)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果和討論

2.1 ASON與MAG3的偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)果

圖1 Sephadex G25凝膠層析結(jié)果Fig.1 Results of Sephadex G25 gel chromatographyA——MAG3-ASON， B——游離(Free)ASON

Sephadex G25凝膠層析可根據(jù)不同分子的分子量大小，有效分離偶聯(lián)和未偶聯(lián)的DNA以及未參與反應(yīng)的雙功能螯合劑。層析產(chǎn)物通過紫外分光光度計(jì)測定OD260 nm值，其中高峰管A為偶聯(lián)產(chǎn)物(MAG3-ASON)，示于圖1。偶聯(lián)產(chǎn)物(MAG3-ASON)通過質(zhì)譜分析，結(jié)果示于圖2。圖2(a)為ASON的質(zhì)譜分析結(jié)果，顯示其相對分子質(zhì)量為5 448.5；圖2(b)為MAG3-ASON的質(zhì)譜分析結(jié)果，顯示其相對分子質(zhì)量為5 796.5，與計(jì)算值相近。

99Tcm為金屬核素，其標(biāo)記ASON最有效的方法就是在ASON末端加上一個(gè)合適的連接子，以使空間位阻最小化，然后通過連接子進(jìn)行放射性核素標(biāo)記。在ASON的3′端NH2與寡核苷酸骨架之間以己基(CH2)6作為連接子，有助于與螯合劑偶聯(lián)。此外，應(yīng)用雙功能螯合劑還可避免由于放射性核素直接標(biāo)記而導(dǎo)致的標(biāo)記底物生物學(xué)活性的損傷[9]。S-Acetyl NHS-MAG3作為一種雙功能螯合劑，常用于99Tcm標(biāo)記[6]。在ASON的5′或3′末端連接一伯胺結(jié)構(gòu)；ASON通過伯胺與NHS-MAG3發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵；在室溫和中性條件下，去除保護(hù)巰基的乙酰基基團(tuán)；通過轉(zhuǎn)螯合作用，NHS-MAG3就能與99Tcm螯合，從而形成穩(wěn)定的放射性標(biāo)記物，結(jié)構(gòu)示于圖3。

圖2 質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.2 Molecular mass of probe measured by MOLDI-TOF analysis(a)——ASON，Mr=5 448.5；(b)——MAG3-ASON，Mr=5 796.5

2.2 MAG3-ASON的99Tcm標(biāo)記結(jié)果

利用放射性核素99Tcm標(biāo)記MAG3-ASON，不同標(biāo)記條件下標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率示于圖4。

圖3 99Tcm-NHS-MAG3-ASON結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Structure of 99Tcm-NHS-MAG3-ASON

紙層析法測定標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率與放射化學(xué)純度。放射性核素99Tcm標(biāo)記MAG3-ASON的反應(yīng)產(chǎn)物有3種成分：① 游離锝；② 水解锝；③ 絡(luò)合锝，即所需的標(biāo)記產(chǎn)物99Tcm-hTERT ASON。前2種是放化雜質(zhì)。3種99Tcm標(biāo)記產(chǎn)物在展開體系中的比移值(Rf)列于表1。

圖4 不同SnCl2用量液體積(b)和反應(yīng)時(shí)間(c)下標(biāo)記產(chǎn)物的標(biāo)記率Fig.4 Labeling efficiency of the product in different conditions: the mass of SnCl2 (a), the volume of (b), reaction time(c)

表和99TcmO2的Rf值Table 1 Rf of 99Tcm-hTERT ASON, and 99TcmO2

按上述反應(yīng)條件，室溫下反應(yīng)15～30 min后，99Tcm-hTERT ASON的標(biāo)記率為76%±5%(n=5)；在相同條件下，無雙功能螯合劑作用，ASON的標(biāo)記率僅為5.0%±1.6%(n=5)；二者比較有顯著差異(P<0.05)。99Tcm-hTERT ASON的放射化學(xué)純度可達(dá)96%以上，比活度為1 850 GBq/g。

圖5 Sephadex G25凝膠層析純化Fig.5 Results of Sephadex G25 gel chromatography

2.3 99Tcm-hTERT ASON的標(biāo)記穩(wěn)定性分析結(jié)果

將99Tcm-hTERT ASON放置在不同條件下(室溫、生理鹽水室溫孵育、正常人新鮮血清37 ℃孵育)，結(jié)果示于圖6。圖6結(jié)果表明，99Tcm-hTERT ASON在24 h內(nèi)的放射性化學(xué)純度均大于93%。

圖6 不同條件下99Tcm-hTERT ASON在24 h內(nèi)的放射化學(xué)純度Fig.6 Radiochemical purity of 99Tcm-hTERT ASON at different conditions during 24 h ◆——室溫(Room temperature)，●——生理鹽水室溫孵育(Incubation with normal saline at room temperature)，△——正常人新鮮血清37 ℃孵育(Incubation with fresh 37 ℃ human serum)

2.4 99Tcm-hTERT ASON的序列穩(wěn)定性分析結(jié)果

體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，不僅要保證99Tcm-hTERT ASON具有良好的放射穩(wěn)定性，更要維持序列完整性，從而保證顯像所必須的序列特異性。PAGE凝膠電泳主要用于檢測小分子核酸的大小，或在同位素標(biāo)記的情況下分析單鏈核酸，如分離寡核苷酸探針、S1核酸酶產(chǎn)物分析和DNA測序等。該方法適用于小分子DNA的分離(以5～500 bp最佳，其中bp表示堿基對)。對單鏈核酸來說，其分辨率可達(dá)1 bp。如果寡核苷酸發(fā)生降解，PAGE電泳結(jié)果上會出現(xiàn)異常條帶。從本研究的PAGE電泳結(jié)果來看(圖7)，僅在18 bp位置出現(xiàn)清晰的電泳條帶。這說明99Tcm-hTERT ASON在人新鮮血清中未發(fā)生任何降解，序列穩(wěn)定性良好。

圖7 PAGE凝膠電泳分析Fig.7 PAGE Gel electrophoresisM——標(biāo)準(zhǔn)(Standard)DNA marker，1——對照組(未與血清孵育)(Control group without incubation)；與血清孵育組(Groups incubated with fresh 37 ℃ human serum )：2——1 h，3——2 h，4——4 h，5——6 h

2.5 99Tcm-hTERT ASON的血清蛋白結(jié)合率

將99Tcm-hTERT ASON放置在正常人新鮮血清(37 ℃)中孵育1、3、6 h后，其與血清蛋白的結(jié)合率分別為15.0%±1.6%、18.0%±1.9%、20.0%±2.4%。

在體內(nèi)，一部分反義顯像劑會與血清蛋白結(jié)合，這使其進(jìn)入靶組織的量減少，而血液中放射性長期處于一較高水平，引起靶/非靶組織(T/NT)的放射性比值下降，從而影響顯像質(zhì)量。若反義顯像劑與血清蛋白結(jié)合率過高，還會對機(jī)體造成額外傷害，更會對寡核苷酸的生物學(xué)特性造成嚴(yán)重影響。然而，反義顯像劑與某些血清蛋白相互作用的消極意義從藥物動力學(xué)角度來看卻是有利的：其與血清蛋白的結(jié)合可使它的血清半衰期延長，且減慢腎臟排泄速度，有利于在腫瘤部位聚集。本研究結(jié)果顯示，99Tcm-hTERT ASON與血清蛋白結(jié)合率在6 h內(nèi)約為20%。99Tcm-hTERT ASON與血清蛋白發(fā)生結(jié)合，可能與硫代磷酸酯寡聚脫氧核糖核酸(phosphorothioate oligonucleotides,PS)的硫原子修飾結(jié)構(gòu)有關(guān)。因?yàn)镻S的主要缺點(diǎn)之一就是在體內(nèi)會與一些蛋白結(jié)合，特別是那些能和帶有多個(gè)負(fù)電荷分子相互作用的蛋白，這種非特異性結(jié)合的原因還不甚明了。

3 結(jié) 論

本課題選擇hTERT為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)、修飾與其特異性結(jié)合的ASON序列，通過雙功能螯合劑S-Acetyl NHS-MAG3進(jìn)行放射性核素99Tcm標(biāo)記。獲得的標(biāo)記產(chǎn)物99Tcm-hTERT ASON具有較高的標(biāo)記率、放射化學(xué)純度和比活度，且放射穩(wěn)定性和序列穩(wěn)定性良好，與血清蛋白具有一定的結(jié)合特性，適合作為反義顯像劑用于進(jìn)一步的顯像研究[10-11]。

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