正交設計法優化伊貝母酒炙工藝

劉雯霞， 陳韓英*， 譚 勇， 王 琪， 李 鵬， 唐代榮

(1.新疆特種植物藥資源省部重點實驗室，新疆石河子832002;2.石河子大學藥學院，新疆石河子832002)

伊犁貝母(Fritillaria pallidi flora Schrenk)為百合科貝母屬植物，其干燥鱗莖是中藥伊貝母的主要來源，有清熱潤肺、化痰止咳功效［1］。伊貝母的主要成分為異甾體生物堿及苷類，尤以西貝素(imperialine)和西貝苷(imperialine-3β-D-glucoside)為其主要成分［2］。藥理研究證明西貝素及其苷對大鼠離體氣管和支氣管有顯著的松弛作用［3］及抗膽堿能活性［4］，是伊貝母的主要活性成分。

伊貝母傳統用藥多為生品，本實驗基于酒炙能夠增強伊貝母中生物堿的溶出度，采用正交優選和高效液相色譜相結合的方法，對能夠影響伊貝母中生物堿溶出率的因素如酒的種類，酒的用量和加熱溫度進行優化，探討不同炮制工藝對伊貝母中生物堿含量的影響，為伊貝母炮制工藝和臨床用藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 HPLC島津LC-20AT高效液相色譜儀(島津);CBM-20A型色譜工作站;SEDEX60 LT型蒸發光散射檢測器(迪瑪);萬分之一天平(賽多利斯)。

1.2 樣品與試劑 伊貝母藥材購自新疆伊犁，經石河子大學藥學院中藥系副教授譚勇鑒定為伊犁貝母(Fritillaria pallidiflora Schrenk)的干燥鱗莖;西貝素標準品(購自中國藥品生物制品檢定所);乙腈(色譜純，江陰精細化工研究所)，蒸餾水(三蒸)，二乙胺(分析純，南京化學工業公司);白酒(酒精度數50度，石河子白楊酒廠)，黃酒(酒精度數13度，紹興糯米老酒)，米酒(酒精度數10度，化正利源酒廠)。

2 方法與結果

2.1 酒炙伊貝母 取凈制的伊貝母100 g，用規定量不同種類的酒拌勻，悶潤至酒被藥材吸盡，置于烘箱內，按照預定的溫度和時間分別烘制，中途翻動1～2次，取出后放涼備用。

2.2 正交實驗 稱取粉碎并干燥的伊犁貝母粗粉，按表1設計的因素水平進行正交實驗，見表1。

表1 因素水平表

2.3 西貝素含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX 80A Extend-C18(5 μL，4.6 mm ×250 mm);流動相:乙腈-水-二乙胺(80 ∶20 ∶0.05);流速:1.00 mL/min。檢測器參數:漂移管溫度:75℃;氮氣流速:2.00 L/min;氣壓:200 kPa。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取在60℃真空干燥至恒重的西貝素對照品10.02 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得對照品貯備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 伊貝母各炮制品分別粉碎過40目篩，干燥至恒重，分別精密稱取各粗粉2.0 g，加氨水0.2 mL浸潤1 h，加混合溶劑氯仿-甲醇(4 ∶1)20.0 mL，稱重，混勻，超聲提取25 min，放置過夜，稱重，加混合溶劑補足重量，濾過，棄去初濾液，收集續濾液10.0 mL，續濾液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗滌，定容于2 mL量瓶中，以峰面積計算西貝素含量。其色譜圖見圖1。

圖1 西貝素對照品(A)，伊犁貝母樣品(B)HPLC色譜圖

2.3.4 標準曲線的制備 精密吸取西貝素對照品貯備液(1.002 mg/mL)1、0.75、0.5、0.275、0.25 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液20 μL，按上述色譜條件測定。以峰面積(y)為縱坐標，進樣量(x)為橫坐標，制作標準曲線，得到回歸方程 y=1.681 6x-1.830 8，r=0.999 6，線性范圍 0.031 63 ～1.012 μg/mL，結果表明在此范圍內存在良好的線性關系。

2.3.5 樣品的含量測定及結果分析 按照2.3.3項供試品溶液的制備方法和2.3.1項下的測定條件，對各酒炙樣品進行含量測定，結果及分析見圖1及表2、表3。

表2 伊貝母中西貝素含量正交試驗結果

表3 方差分析表

分析結果表明，三因素中B因素即酒的用量對實驗結果影響最大，為伊貝母酒炙的主要影響因素，加熱溫度C為次要因素，各因素對西貝素含量的影響結果依次為B＞C＞A。進一步的方差分析說明(結果見表3)，只有因素B對西貝素的含量有顯著性的影響，綜合分析，在伊貝母酒炙工藝中，最佳工藝條件為A1B3C3，即40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干。

2.4 精密度實驗 精密吸取同一濃度的西貝素對照品溶液，按照上述色譜條件，連續測定6次，記錄峰面積，結果西貝素峰面積的RSD=1.2%(n=6)，結果表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性實驗 取2.6項重復性試驗下同一份供試品溶液，按照上述色譜條件，12 h內每2小時測定一次西貝素的峰面積。結果表明供試品溶液在12 h內穩定，其峰面積的RSD=1.8%(n=6)。

2.6 重復性實驗 精密稱取伊犁貝母炮制品1號粉末1.0 g，平行6份，按2.3.3項供試品制備方法制備供試品溶液，以外標法計算西貝素的含量(%)，計算測定結果的RSD為2.8%(n=6)。

2.7 加樣回收率實驗 取已知含量的伊犁貝母藥材粉末1.0 g，平行6份，按照高中低分別精密加入西貝素對照品，按2.3.3項供試品制備方法制備供試品溶液，計算加樣回收率。結果西貝素平均回收率為100.95%。RSD為1.18%。結果見表4。

表4 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.8 驗證實驗 為確證該工藝的穩定性，在上述正交實驗的基礎上，按篩選的最佳工藝條件，進行了重復驗證實驗，并與生品進行含量對比。稱取凈制的生品伊貝母100 g，按2.3項下“西貝素含量測定法”各進行3次實驗，生品伊貝母西貝素平均含量為0.066%(RSD=1.90%)。另取生品伊貝母100 g，按照以上最優炮制工藝參數各進行3次實驗，炮制伊貝母平均含量為0.092%(RSD=1.80%)，表明優選工藝切實可行。

2.9 水煎液中西貝素含量測定 中藥飲片多為水煎使用，該實驗對生品及炮制品中西貝素含量進行比較。取2.8項下樣品，分別精密稱取各粗粉2.0 g，加水20.0 mL，稱重，混勻，煎煮 60 min，放置過夜，稱重，加水補足重量，濾過，棄去初濾液，收集續濾液10.0 mL，續濾液于水浴上蒸干，以甲醇溶解，充分洗滌，定容于2 mL量瓶中，以峰面積計算西貝素含量。結果見表5。

3 討論

本實驗所用的流動相為乙腈-水-二乙胺，經查閱相關資料，有3種比例可用于該實驗，分別為55∶45 ∶0.05、70 ∶30 ∶0.05、80 ∶20 ∶0.05，本實驗結果表明，80∶20∶0.05為最佳流動相比例。

表5 生品與炮制品伊貝母水煎液西貝素含量比較

由實驗數據分析可知，酒的用量對實驗結果有顯著性影響，得到最佳工藝條件為A1B3C3，即40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干。因此在對伊貝母進行酒炙時必須注意酒的用量，該實驗認為110～120℃為最佳溫度條件，可能是溫度升高后有利于伊貝母中生物堿的溶出。驗證試驗對生品伊貝母與最佳工藝炮制品西貝素含量比較，生品伊貝母明顯低于炮制品含量。并分別對其水煎液進行含量測定，同樣生品水煎液中西貝素含量明顯低于炮制品?？梢娊浘浦颇軌蛎黠@提高伊貝母中西貝素的溶出率。

實驗優選最佳工藝40 g/100 g凈藥的白酒110～120℃烘干與傳統工藝低度黃酒工藝不一致，筆者認為伊貝母中西貝素屬西藜蘆堿類，為極性較小的脂溶性生物堿，降低極性能夠增加西貝素溶出，白酒度數較黃酒高，就達到了西貝素溶出率提高的目的，同時酒的用量也較傳統10～30 g用量高，同樣反映出了極性對西貝素溶出率的影響。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:95-96.

［2］伊江蘭，麥迪尼亞提.伊貝母總生物堿的研究概述［J］.新疆中醫藥，2002，20(4):77-79.

［3］Chan SW，Kwan Yw，Lin G，et al.The effects of Fritillaria alkaloids on isolated trachea and bronchi［J］.Pharm Sci，1998，1:369.

［4］Atta-ttr-Rahman，Choudhary MI，Farooq A，et al.Structure activity relationships of imperialine derivatives and their antichotinergic activity［J］.Planta Med，1998，64(2):172-174.