雌激素對大鼠顱腦創傷后腦組織傷區 Bcl-2和 Bax表達的影響

霍龍偉 張建生 王小強 楊文征 姚焱鵬

雌激素對大鼠顱腦創傷后腦組織傷區 Bcl-2和 Bax表達的影響

霍龍偉 張建生 王小強 楊文征 姚焱鵬

目的 探討雌激素是否通過影響大鼠顱腦創傷后腦組織傷區 Bcl-2和 Bax表達,起到腦保護作用。方法 采用改良的 Feeney自由落體腦損傷模型,將 60只 Wistar健康雄性大鼠隨機分為治療組、對照組和外傷組,治療組的大鼠用苯甲酸雌二醇治療。應用 HE染色檢測腦組織和應用免疫組織化學方法檢測傷區腦組織 Bcl-2及 Bax的表達變化,并且計算出 Bcl-2和 Bax表達的比值。結果 治療組Bcl-2表達高于對照組和創傷組(P＜0.05),創傷組和對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。三組的 Bax表達相互比較差異無統計學意義(P＞0.05)。治療組 Bcl-2和 Bax表達的比值高于對照組和外傷組。結論 雌激素可能是通過促進 Bcl-2表達來減少顱腦損傷后神經細胞的凋亡,發揮腦保護作用。

顱腦創傷;雌激素;Bcl-2;Bax

越來越多的證據表明,性別差異對腦損傷預后有明顯影響,并認為雌激素可能具有腦保護作用[1,2]。但是有關雌激素對腦保護研究主要在缺血性腦病方面,而與顱腦創傷(TBI)關系及其發生機制少有研究。本研究旨在通過研究大鼠 TBI后,雌激素是否影響傷區神經細胞 Bcl-2和Bax表達,從而了解雌激素對 TBI的保護作用,為防治 TBI提供新的希望。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠 60只,體質量 265～310g(由甘肅省中醫學院 SPF級動物實驗中心提供,并在其內進行實驗)。隨機分為治療組、對照組、外傷組,每組 20只大鼠。根據傷后處死時間點不同,將每組大鼠再分為 12、24、48、72h組,共 5個亞組,各個亞組動物 5只。治療組:用改良 Feeney自由落體腦損傷裝置致傷動物,并給予苯甲酸雌二醇(1mg/kg·d)腹腔注射治療,于傷后立即治療 1次,以后每天治療 1次,直至動物處死;對照組:同法致傷動物,并給予等量生理鹽水腹腔注射治療;外傷組:同法致傷動物不予治療。

1.2 試劑及儀器 苯甲酸雌二醇由廣州白云山明興制藥有限公司提供;Bcl-2和 Bax試劑盒由美國 Bioworld Technology Inc公司提供;DAB顯色盒和鼠抗兔 IG由博士德公司提供;顯微鏡 CX 31來源于 Olympus公司;顯微處理系統來源山東易創;BZ-2000圖像分析系統來源于成都泰盟。

1.3 模型制備 所有動物用 10%水合氯醛 350mg/kg腹腔內注射麻醉大鼠,剪去大鼠頭部毛發俯臥固定于實驗臺上,消毒,沿中線切開頭皮約 2.0 cm,暴露頂部,于右側中線旁 2 mm、冠狀縫后 4mm處,牙科鉆鉆一直徑約 5 mm骨窗,保持硬腦膜完整,按改良的Feeney法(擊錘重 20 g,底面直徑約 4 mm,30 cm高處自由落體)致大鼠右頂葉腦創傷模型,骨蠟封閉,縫合頭皮后自由喂養。

1.4 標本采集 按照實驗設計方案取不同的時間點的大鼠,經麻醉、開胸、經左心室插管、剪開右心耳、用生理鹽水沖洗直至清亮、用 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注固定 60min后,取出大腦置于 4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定 24 h后,在腦組織損傷區做冠狀切面,常規石蠟包埋、切片。

1.5 HE染色和Bcl-2和 Bax免疫組織化學方法 取各組石蠟切片行常規 HE染色和嚴格按照SP法行免疫組織化學,先進行脫蠟、水化、PBS洗 3次、抗原修復、PBS洗 3次、加封閉液、加Ⅰ抗、4℃過夜、PBS洗 3次、加Ⅱ抗、PBS洗 3次、DAB顯色、蘇木精復染 2m in、鹽酸酒精分化、DAB溶液顯色、自來水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。鏡下觀察陽性細胞胞漿呈棕黃色。

1.6 結果觀察 光鏡下觀察 HE切片和應用軟件圖像分析系統,在 400倍鏡下計數 Bcl-2和Bax的陽性細胞率。計數方法:每張切片取8個高倍視野,每個視野計數陽性細胞所占的百分比,再取這 8個高倍視野陽性細胞所占的百分比平均值代表該張切片陽性細胞率,同法記數各時間點切片的陽性細胞數,總平均數代表該時間點的陽性細胞率,均以百分比表示。

1.7 統計學方法 實驗中所得 Bcl-2和Bax數據用±s表示,用 SPSS 11.0統計軟件進行成組設計 t檢驗,檢驗水準取雙側 α=0.05。Bcl-2陽性細胞率與 Bax陽性細胞率均數比值是通過均數比值計算公式得出。

2 結果

2.1 HE染色后在光鏡下觀察到 治療組中神經細胞結構較清晰,未見明顯的神經細胞核固縮、核碎裂、核染色質邊集現象,排列分布均勻(圖 1);對照組和外傷組中可見局灶性壞死,少量神經細胞腫脹,胞漿周圍出現空暈,排列較松散,并伴有明顯的神經細胞核固縮、核碎裂,凋亡細胞皺縮,胞漿嗜酸性增強,胞質致密,核染色質邊集(圖 2)。

2.2 Bcl-2陽性細胞主要位于損傷鄰近區(圖 3),遠離損傷區可見少量陽性細胞(圖4);Bc1-2陽性細胞染色位于細胞漿和(或)核周,為棕黃色;治療組 Bcl-2陽性細胞百分比在傷后24 h達到高峰,隨后逐漸下降;外傷組和對照組Bcl-2陽性細胞百分比在傷后 48 h達到高峰,隨后逐漸下降;治療組與外傷組、對照組各個時間點相比,Bcl-2陽性細胞百分比明顯增高,具有統計學差異,而外傷組和對照組之間則無統計學差異(表 1)。

2.3 Bax陽性細胞同樣為細胞漿著色位于細胞漿和(或)核周,為棕黃色,位于損傷鄰近區(圖 5);遠離損傷區可見少量陽性細胞(圖 6),各組Bax陽性細胞在傷后早 24h達到高峰,隨后逐漸下降;各組的Bax陽性細胞百分比在各個時間點相互比較,無統計學差異(表 2)。

2.4 三組Bcl-2陽性細胞率與Bax陽性細胞率均數比值在同時間點相比較,治療組的比值是最高的,并且在 24、48、72 h時間點比值超過 1.0,而對照組、外傷組均數比值最高值都沒有超過 1.0(表 3)。

表 1 大鼠腦創傷后Bcl-2陽性細胞率變化(±s,%,n=5)

表 1 大鼠腦創傷后Bcl-2陽性細胞率變化(±s,%,n=5)

注:a治療組分別與對照組和外傷組比較差異有統計學意義(P＜0.05);b對照組與外傷組比較差異無統計學意義(P＞0.05)

組別 12 h 24 h 48 h 72 h治療組 24.94±0.78a 40.76±0.34a 38.71±0.25a 36.26±0.68a對照組 20.53±0.96b 25.23±0.19 b 34.42±0.54b 28.23±0.14b外傷組 20.79±0.52 24.98±0.43 33.86±0.87 28.12±0.23

表 2 大鼠腦創傷后Bax陽性細胞率變化(±s,%,n=5)

表 2 大鼠腦創傷后Bax陽性細胞率變化(±s,%,n=5)

注:a治療組分別與對照組和外傷組差異無統計學意義(P＞0.05);b對照組與外傷組比較差異無統計學意義(P＞0.05)

組別 12 h 24 h 48 h 72 h治療組 26.47±0.11a 39.61±0.50a 37.41±0.86a 32.67±0.56a對照組 27.43±0.87b 40.44±0.75b 37.86±0.62b 32.23±0.29b外傷組 26.99±0.62 39.54±0.91 38.21±0.33 32.43±0.81

表 3 大鼠腦創傷后Bcl-2陽性細胞率與Bax陽性細胞率均數比值變化

3 討論

隨著對腦損傷深入研究和分子生物學技術的發展,發現腦損傷后細胞凋亡對腦神經細胞有著重要的影響[3]。在細胞發生凋亡的機制中,Bax和Bcl-2是影響細胞凋亡重要因素之一。Bax表達可促進細胞凋亡,它主要通過自身兩個 Bax形成同源二聚體并表達蛋白,其表達蛋白通過介導線粒體膜細胞色素 C得以穿過線粒體膜,并進一步激活caspase-9以及caspase-3,最終導致細胞凋亡[4]。Bcl-2表達則抑制細胞凋亡,它主要通過和Bax競爭性結合,形成更為穩定的異源二聚體,從而減少Bax形成同源二聚體,抑制Bax蛋白表達起抗凋亡作用[5]。因此Bcl-2/Bax比例也是決定細胞是否凋亡重要因素之一。正常情況下 Bcl-2/Bax比例保持著動態平衡,當在病理情況下,比值下降時,細胞就開始凋亡[6]。

雌激素是由雌激素合成酶催化雄激素轉化而來的,其生理活性最強的是雌二醇。腦作為雌激素重要的靶器官之一,腦內很多核團能產生雌激素合成酶并表達雌激素受體,因此雌激素對腦的發育與腦功能發揮起著十分重要的調節作用[7]。本研究表明治療組即雌激素組的 Bcl-2表達在傷后 24 h達高峰,48h和 72h逐漸下降。外傷組和對照組Bcl-2表達在傷后逐漸增高于 48h達高峰以后逐漸下降,并且高峰值低于同時間點治療組峰值,而且下降速度快于治療組。因此從本實驗結果表明大鼠TBI后,雌激素可以上調抑制凋亡因子Bcl-2表達,這與國內外的一些研究結果相類似[8,9]。有學者研究認為雌激素可能通過激活 PI3-K-AKT信號途徑激活,再激活第二信使環腺苷酸-蛋白激酶 A-環腺苷酸反應元件結合蛋白途徑,進而上調 Bcl-2表達[10]。Bax表達在本實驗中表達高峰發生在 24h,以后逐漸下降,并且治療組、對照組和外傷組相互比較均無統計學差異。這表明雌激素對Bax表達可能不具有影響。但從各組 Bcl-2陽性細胞率與Bax陽性細胞率在各個時間點均數比值分析可以進一步表明雌激素抑制凋亡是通過提高 Bcl-2表達,進而提高 Bcl-2/Bax比值,減少 Bax形成同源二聚體,抑制神經細胞凋亡,從而減輕TBI對腦功能的損害。

本研究還發現大鼠顱腦創傷后,Bcl-2和Bax高表達發生在損傷鄰近區而不是在損傷區和遠離損傷區。這可能損傷區神經細胞已經壞死而無表達能力,遠離損傷區低表達可能與該區受損程度輕有關。通過 HE染色觀察發現,治療組與對照組、外傷組相比較,神經細胞損傷明顯減輕,這從另一方面提示雌激素可能通過抑制神經細胞凋亡,減輕神經細胞損傷,發揮腦保護作用。

總之,雌激素對TBI后腦保護機制非常復雜,并且有諸多爭議[11]。本研究結果顯示,雌激素可以通過上調Bcl-2的表達,減少神經細胞凋亡,但是有關雌激素對神經細胞凋亡調控機制還是有待于進一步研究。

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Effect of estrogen on the expressions of Bcl-2 and Bax genes of impaired brain tissue after traumatic head injury in rats

HUOLong-wei,ZHANG Jian-sheng,REN Hai-jun,etal.The Second Hospitalof Lanzhou University,Lanzhou730030,China

Objective To investigatewhether estrogen do have the brain protective function,by regulated the expression of Bcl-2 and Baxon the impaired brain tissueof ratswith traumatic head injury(TBI).Methods TBImodel was established according to Feeney'smethod.Sixtymale rats were divided into 3 groups,i.e.treatment group,controlgroup and wound group.Themale ratswere treatmentby injection ofestrogen in the treatment group.The brain tissuewas determined by Hematoxylin and eosin(HE)staining and image analysis.Expressionsof Bcl-2 and Bax in the brain tissuewere determined respectively by immunohistochemical technique in all the rats and Bcl-2 and Bax expression's ratio is calculated.Results The expression of Bcl-2 was significantly higher in the treatmentgroup than the control group and the wound group(P＜0.05).Therewas no significant difference between the expression of Bcl-2 in the controlgroup and thatof Bcl-2 in thewound group(P＞0.05).Therewere no significant differences in the expression of Bax among the three groups at every stage(P＞0.05).The expression's ratio of the treatment group's Bcl-2 and Bax is higher than that of the control group and thatof the wound group.Conclusion Estrogen can reduce theneuralapoptosis of impaired brain tissue after TBI in rats through promoting the expression of Bcl-2.

Traumatic head injury;Estrogen;Bcl-2;Bax

730030蘭州大學第二醫院神經外科

·臨床案例·