蛇床子素在兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究

鄭立卿， 張丹參，2*， 張 力， 薛貴平， 武海霞

(1.河北北方學(xué)院藥理教研室，河北張家口075000;2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊051500)

蛇床子素(Osthol，Ost)，是從傘形科植物蛇床干燥成熟果實(shí)蛇床子中提取的單體成分，是一種烴基香豆素衍生物［1］。藥理作用廣泛，可抑菌［2］，調(diào)節(jié)肝臟代謝酶的功能［3］，抑制腫瘤細(xì)胞增殖［4］，保肝護(hù)肺［5-6］等。在國內(nèi)雖應(yīng)用廣泛，研究報(bào)道多集中于化學(xué)成分、含量測定、制備工藝、藥理作用、臨床應(yīng)用和體內(nèi)測定方法。但臨床藥理學(xué)研究資料報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法研究了兔血漿中Osthol，首次以3個(gè)劑量組對其進(jìn)行藥動學(xué)研究，考察此常規(guī)劑量范圍內(nèi)是否符合線性動力學(xué)特征，為其安全、合理用藥提供依據(jù)。首次研究了ip、iv、ig 3種給藥途徑的藥代動力學(xué)特點(diǎn)，闡明蛇床子素在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

動物 新西蘭白兔，體重(2.0±0.3)kg，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，給藥前禁食12 h，自由飲水。

儀器與條件 D-37520超速低溫離心機(jī)(德國Heraeus公司)。

惠普1100系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，紫外監(jiān)測器，色譜柱:YWG-C18(4.6 mm×250 mm，10 μm)(大連依利特公司)，流動相∶甲醇-水(80∶20)，流速:1 mL/min，檢測波長:322 nm，柱溫:27℃，用微量進(jìn)樣器手動進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μL，內(nèi)標(biāo):丹皮酚。

藥品和試劑 蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品，純度98.8%(批號110822-200608)，丹皮酚(paeonol)標(biāo)準(zhǔn)品(批號110708-200505)均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇和乙腈均為色譜純，其他化學(xué)用品為化學(xué)純，實(shí)驗(yàn)用水全部為三重蒸餾水。

血漿處理 精密量取血漿100 μL加入乙腈200 μL(含內(nèi)標(biāo))，充分震蕩搖勻后12 000 g冷凍(-5℃)離心6 min，分離沉淀蛋白，吸取上清液過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，置-20℃冰箱保存，備測。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 從色譜圖上可以看出，蛇床子素的保留時(shí)間為6.8 min，內(nèi)標(biāo)丹皮酚的保留時(shí)間為4.5 min，專一性好，峰型良好且與雜質(zhì)峰分離較好，血漿色譜圖見圖1。

圖1 空白血漿(A)、含內(nèi)標(biāo)血漿(B)、血漿樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank plasma plasma(A)，plasma with interior(B)，and plasma samble(C)

2.2 生物樣品中蛇床子素測定方法的確認(rèn)

2.2.1 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 等比稀釋法配制0.125、0.25、0.5、1、2 和 4 μg/mL 的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品。處理后，HPLC測定。蛇床子素與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(A)對濃度(C)進(jìn)行回歸計(jì)算得到的回歸方程為:A=0.360 2 ×C+0.050，r=0.999 3，線形范圍為0.125～4.000 μg/mL。最低檢測濃度為6.25 ×10-3μg/mL。

2.2.2 回收率和精密度實(shí)驗(yàn) 平行配制0.5、1.0和4.0 μg/mL三個(gè)濃度的蛇床子素血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液各3份，按“血漿處理”項(xiàng)下操作處理，HPLC測定，所測得的峰面積與相同濃度溶劑配置的溶液的峰面積的比值即為絕對回收率，分別為89.02%、90.40%和91.3%;峰面積代入回歸方程求得的濃度與實(shí)際濃度比值為相對回收率，分別為102.5%、101.2%、98.8%(n=4)，日內(nèi)精密度(RSD，n=3)分別為2.5%、3.6%、3.2%。按上法平行操作連續(xù)測定3 d，得到日間 RSD(n=9)分別是 4.5%、5.8%、5.4%。

2.3 藥代動力學(xué)研究

2.3.1 腹腔給藥 18只白兔，隨機(jī)分成3組。氨基甲酸乙酯(iv，1 mg/kg)麻醉后，分離頸總動脈，連接在“三通”管兩端，iv1%肝素鈉1 mL/kg肝素化動物。循環(huán)約10 min。清醒后三組分別ip蛇床子素15、30 和60 mg/kg 三個(gè)劑量，于給藥后的 5、10、20、30、45、60、75、90、110、125 min，取血約 1 mL，制備血漿樣品并測定藥物含量，繪制時(shí)量曲線，將數(shù)據(jù)用3P87程序擬合。結(jié)果見圖2，表1。

圖2 三個(gè)劑量15、30、60 mg/kg-ip給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線(每個(gè)點(diǎn)代表6個(gè)血藥濃度的±s)Fig.2 Plasma concentration-time curves of osthol after a single ip dose of 15，30，60 mg/kg to rabbits.(Each point represents the mean data from 6 rabbits，±s)

表1 藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Table 1 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

表1 藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Table 1 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

*P＜0.05 15 vs 30 mg/kg;▲P＜0.05 30 vs 60 mg/kg

參數(shù) 單位劑量/(mg/kg)5.697±1.2 2.736±1.3 0.807±7.2 Ke min-1 0.013±0.003 0.012±0.002 0.014±7.2 Ka min-1 0.210±0.1 0.172±0.2 0.180±0.1 t1/2(Ka) min 8.12±2.3 10.43±3.2 7.57±2.1 t1/2(Ke) min 82.66±5.2▲ 52.41±7.2*▲ 52.42 ±5.7*T(peak) min 23.35±7.4 29.50±7.6 28.94±6.9 C(max) μg·mL-1 3.57±1.6▲ 1.60±0.7*▲ 0.87±0.6*CL kg-1·min-1 0.22±0.1 0.29±0.1 0.11±0.1 AUC μg·min·mL-1 306.64±27.2▲ 147.98±17.7*▲ 62.73±7.2*60 30 15 A μg·mL-1 MRT min 50.87±7.8 60.63±6.2 60.05±8.2

從圖中可以看出:3個(gè)給藥劑量均可在5～20 min左右的時(shí)間里達(dá)到最高血藥濃度，然后開始下降。60 mg/kg劑量給藥時(shí)，在10 min左右即可達(dá)到3.5 μg/mL的血藥高峰，然后很快下降，但在120 min時(shí)，血藥濃度仍可達(dá)1.5 μg/mL;30 mg/kg劑量給藥時(shí)在5 min可以達(dá)到1.6 μg/mL的高峰，然后就開始下降，到120 min時(shí)血藥濃度可降為0.5 μg/mL;15 mg/kg劑量給藥時(shí)，在20 min左右也可逐漸出現(xiàn)血藥濃度的高峰0.9 μg/mL，但下降非常緩慢，在給藥后120 min時(shí)血藥濃度仍可維持在0.5 μg/mL。

用3P87藥代動力學(xué)軟件對蛇床子素在兔體內(nèi)的血藥濃度曲線分別按一室、二室、三室進(jìn)行Marquard擬合，對3種模型利用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，ip3種劑量蛇床子素在家兔體內(nèi)的動力學(xué)行為符合符合一級消除一室模型，藥物代謝動力學(xué)參數(shù)見表1，其中3種劑量 AUC分別為306.64、147.98、62.73(μg·min)/mL，與劑量呈正比(r=0.999 8)，說明在此劑量范圍內(nèi)本品在兔體內(nèi)的消除為線性動力學(xué)。

2.3.2 靜脈給藥 白兔6只，iv蛇床子素15 mg/kg，于不同時(shí)間由頸動脈取血，測定血漿藥物濃度，繪制藥時(shí)曲線，計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)(表2，圖3)。結(jié)果表明，iv蛇床子素，屬一級吸收，一級消除二室模型。

表2 蛇床子素15 mg/kg藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Table 2 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

表2 蛇床子素15 mg/kg藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n=6)Table 2 Pharmacokinetics parameters(±s，n=6)

參數(shù) 單位 蛇床子素溶液 參數(shù) 單位 蛇床子素溶液A μg·mL-1 15.5 ±7.2 T1/2βmin 20.4±2.29 B μg·mL-1 2.1±1.0 K21 min-1 0.038±0.009 min-1 0.167±0.015 K12 min-1 0.048±0.006 β min-1 0.013±0.004 K10 min-1 0.056±0.008 Vc L·kg-1 0.81±0.24 AUC μg·min·mL-1 335.2±84.6 T1/2α min 6.5 ±2.2 CL(s) L·kg-1·min-1 α 0.057±0.005

圖3 15 mg/kg iv給藥后的血藥濃度-時(shí)間曲線(每個(gè)點(diǎn)代表6個(gè)血藥濃度的±s)Fig.3 Plasma concentration-time curves of osthol after a single dose of 15 mg/kg to rabbits.(Each point represents the mean data from 6 rabbits，±s)

2.3.3 灌胃給藥 白兔6只，ig蛇床子素60 mg/kg，于給藥后不同時(shí)間取血，測定血漿藥物濃度，結(jié)果僅在ig后30、60 min測得原型藥，濃度很低，其他各時(shí)間點(diǎn)均未檢出。

2.3.4 血漿蛋白結(jié)合率 采用平衡透析法。透析袋6 mm×10 cm，袋外液為30 mL磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L，pH=7.4)，內(nèi)含0.15 mol/L 氯化鈉，蛇床子素的濃度為分別為2、10、20 μg/mL(n=16)于恒溫振蕩器內(nèi)25℃恒溫下緩慢振蕩，透析72 h后，按下式計(jì)算蛇床子素與兔血漿蛋白結(jié)合率。

藥物血漿蛋白結(jié)合率=(袋內(nèi)濃度-袋外濃度)/袋內(nèi)濃度×100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛇床子素的兔血漿蛋白結(jié)合率分別為81.53% ±4.31%，70.50%±4.68%，77.21% ±1.37%。血漿蛋白結(jié)合率為76%。

3 討論

蛇床子素ip吸收快，消除快，3個(gè)劑量t1/2依次為82.7、52.4、52.4 min，AUC 依次為 306.64、147.98、62.73;iv蛇床子素15 mg/kg相對消除快(t1/2=20.4)，生物利用度高 AUC=335.2;與 iv相比，ip蛇床子素15 mg/kg后的消除半衰期明顯延長(P＜0.001)，但很不完全，生物利用度很低(18.8%)。藥代動力學(xué)處理結(jié)果表明，兔ip蛇床子素后的藥代動力學(xué)過程符合一室模型，iv藥代動力學(xué)過程符合二室模型，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［8］。

不同給藥途徑半衰期的差異，我們推測可能與兩種給藥途徑的不同組織分布有關(guān)。已有數(shù)據(jù)證明ip蛇床子素后的組織分布情況都表現(xiàn)出分布在生殖系統(tǒng)和血竇豐富的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血漿，腦組織藥物濃度最低［9］且血漿蛋白結(jié)合率較高。因此推測，ip后兔的脂肪組織可能成為蛇床子素的一個(gè)“儲庫”，藥物從脂肪組織中緩慢釋放入血，導(dǎo)致ip的血漿消除半衰期較長。

蛇床子素ip 15、30、60 mg/kg劑量達(dá)峰時(shí)間沒有大的差別(P＞0.05)，加大劑量時(shí)峰值并未滯后，提示多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的存在，在高劑量時(shí)體內(nèi)攝取藥物的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］You L，F(xiàn)eng S，An R，et al.Osthole:a promising lead compound for drug discovery from a traditional Chinese medicine(TCM)［J］.Nat Prod Commun.2009 Feb;4(2):297-302.

［2］Shi Z，Shen S，Zhou W，et al.Fusarium graminearum growth inhibition due to glucose starvation caused by osthol［J］.Int J Mol Sci，2008，9(3):371-382.

［3］Zhang Y，Xie ML，Xue J，et al.Osthole regulates enzyme protein expression of CYP7A1 and DGAT2 via activation of PPARalpha/gamma in fat milk-induced fatty liver rats［J］.J Asian Nat Prod Res，2008，10(7-8):807-812.

［4］龔海英，張 麗，李建宇，等.蛇床子素對乳腺癌MCF27細(xì)胞增殖的影響［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，17(4):281.

［5］劉建新，周 俐，周 青，等.蛇床子素對小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(2):21-22.

［6］王志斌，梁智星.蛇床子素在家兔心肺聯(lián)合移植中對供肺的保護(hù)作用［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(4):426-428.

［7］劉曉燕，王本杰，袁桂艷，等.卡維地洛人體藥動學(xué)與藥效學(xué)結(jié)合模型研究(英文)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(4):406-411.

［8］王 堃，蘇成業(yè).β-欖香烯在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)及體內(nèi)過程［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000，35(10):725-728.

［9］鄭立卿，張丹參，劉建華.RP-HPLC法研究蛇床子素在大鼠組織的分布［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41(21):1667-1668.