Ghrelin活化人T細胞翻譯起始分子通過m TOR信號轉導通路①

崔天盆 胡必成 （武漢市第一醫院臨床免疫學實驗室,武漢 430022）

Ghrelin活化人T細胞翻譯起始分子通過m TOR信號轉導通路①

崔天盆 胡必成 （武漢市第一醫院臨床免疫學實驗室,武漢 430022）

目的:探討Ghrelin活化人T細胞翻譯起始分子的信號轉導機理。方法:采用微柱法分離人外周血T細胞,采用Western blot方法檢測mTOR信號通路分子和蛋白質翻譯調控分子的磷酸化狀態和含量。采用mTOR抑制劑:雷帕霉素,PI3KⅠ抑制劑:LY294002,PI3KⅢ抑制劑:3-甲基腺嘌呤,Ghrelin拮抗劑:Des-Lys-3-GHRP6和AKT抑制劑:A443654和Ghrelin研究相應信號通路。結果:①人T細胞表面有Ghrelin受體（GHSR1a）表達。②Ghrelin與GHSR1a結合后可活化mTOR。③Ghrelin磷酸化兩個mTOR下游靶分子4E-BP-1和P70S6K,P70S6K進一步磷酸化核糖體S6蛋白。④Ghrelin磷酸化蛋白質翻譯起始帽子結構的兩個重要分子eIF4E和eIF4G。結論:Ghrelin促進人T細胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉導通路。

Ghrelin;哺乳類雷帕霉素靶蛋白;T細胞;蛋白質翻譯

Ghrelin是由胃X/A樣內分泌細胞分泌的胃腸肽激素,饑餓時血中濃度最高,進食1小時后最低。GHRP-6是最早發現的不與生長激素釋放激素受體結合的促進生長激素分泌的多肽,隨后發現一系列肽類和非肽類促生長激素分泌的化合物,稱之為生長激素促分泌素（growth hormone secretagogues,GHSs）,1995年Howard[1]從垂體和下丘腦克隆到可與GHS結合的孤兒受體——生長激素促分泌素受體1a（GH secretagogue receptor 1a,GHSR1a）。然而直到1999年Kojima[2]才從胃中克隆純化GHSR1a內源性配體——Ghrelin。Ghrelin是含 28個氨基酸的多肽,Ghrelin氨基端第三位絲氨酸被辛烷化,且目前認為辛烷化Ghrelin可與GHSR結合,是Ghrelin的活化形式。Ghrelin能促進進食和體重的增加,其促進進食的效應強于目前已知的神經肽Y（neuropeptide Y,NPY）,而且長期應用Ghrelin能增加體重。此外Ghrelin/GHSR1a還有其他中樞和外周功能,如激素分泌、血糖穩定、胰腺功能、生殖、胃腸蠕動、心血管功能、細胞分化和生存、免疫和炎癥、骨代謝、記憶和睡眠等。Ghrelin的系列功能是通過Ghrelin與GHSR1a結合從而啟動胞內信號轉導來實現的。

不同作者對Ghrelin與GHSR1a結合后啟動的信號轉導機理進行研究[3,4]。發現一些信號分子參與Ghrelin的信號轉導。使用HEK293和CHO細胞表達GHSR1a,通過同位素結合分析、激光共聚焦顯微鏡分析,受體活化后胞內Ca2+濃度升高。Ghrelin作用于豬生長激素細胞通過AC/PKA、PLC/PKC和胞內鈣通路轉導信號。除了Ghrelin介導的離子電流效應,Ghrelin通過MAPK介導細胞分化功能,采用CHO細胞穩定表達GHSR1a模型,研究發現Ghrelin通過PLC、PKCε活化 ERK1/2通路。然而在3T3-L1前脂肪細胞,Ghrelin通過PI-3K/AKT和百日咳毒素敏感G蛋白（Gi/o）活化MAPK。在胰腺癌細胞也發現通過PI3-K/AKT通路。在人和大鼠腎上腺小球細胞（adrenal zona glomerulosa cells）,Ghrelin促進細胞分化通過ERK1/2,而不依賴PKA和PKC。在肝細胞,Ghrelin磷酸化IRS-1和結頭蛋白-生長因子受體結合蛋白2及MAPK,因此在這種細胞GHSR的信號轉導與胰島素的信號分子交叉,Ghrelin和胰島素聯合應用可增加IRS-1的磷酸化。

人T細胞和單核細胞表達Ghrelin和Ghrelin受體,Ghrelin通過Ghrelin受體特異性抑制前炎性細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表達。Ghrelin以劑量依賴方式抑制瘦素誘導的前炎性細胞因子表達。用Ghrelin治療LPS誘導鼠內毒素模型,發現Ghrelin有抗炎效應。應用Ghrelin或GHSR激活有助于改善疾病相關的惡液質。

隨著年齡增長,胸腺表達Ghrelin和Ghrelin受體減低,用Ghrelin治療14月齡小鼠可顯著改善胸腺結構和增加胸腺細胞數量,增加胸腺流出和改善外周T細胞TCR多樣性[5,6]。

本文旨在研究Ghrelin作用T細胞的信號轉導機理,由于Ghrelin的基本功能是調節機體進食、代謝和能量平衡,因此我們選擇哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）信號轉導通路作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康獻血者,年齡35～55歲,不吸煙,無過敏史。采集外周血200m l。

1.2 試劑 高純度人Ghrelin（純度=98.7%）購自EZbiolab公司（EZbiolab Inc.Westfield,IN 46074,USA）;（D-Lys3）-GHRP-6（純度＞95%,Phoenix Pharmaceuticals Inc.Burlingame,CA 94010,USA）。PI3K 抑制劑—LY294002（Calbiochem,La Jolla,CA）,雷帕霉素（rapamycin,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA）。3-甲基腺嘌呤（Sigma:M 9281）;Akt inhibitor（2S）-1-（1HIndol-3-yl）-3-[5-（3-methyl-2H-indazol-5-yl）pyridin-3-yl]oxypropan2-amine（A443654,Invitrogen）,RIPA緩沖液（Sigma R0278,Saint Louis,M issouri 63103）,蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor cocktail,Sigama P8340）,磷酸酶抑制劑（Phosphatase inhibitor cocktail1,Sigma P8340和Phosphatase inhibitor cocktail2,Sigma P5726）。

1.2 研究方法

1.2.1 人T細胞分離 首先用Ficoll分離液分離人外周血單個核細胞（包括淋巴細胞和單核細胞）,用R&D公司（R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,USA）的T細胞富集柱（Cat#:HTCC-25）用高親和陰性選擇法分離T細胞,具體參照R&D公司的使用說明書,T細胞純度為95%。簡言之,外周血單個核細胞通過抗免疫球蛋白包被的T細胞富集柱,B細胞通過BCR與抗體結合,而單核細胞通過Fc受體結合后留在富集柱上,用相應緩沖液洗滌三次,得到純度大于95%的T細胞。

1.2.2 免疫印跡（Western blot） 人外周血T細胞加入含青霉素、鏈霉素的RPMI,37℃5%CO2培養箱中,血清饑餓過夜。使用Ghrelin或適當抑制劑,每10×106人外周血T細胞加入0.1 ml含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液,T細胞RIPA裂解液置冰上15分鐘,4℃14 000 r/min離心15分鐘,上清轉入另一近潔凈EP管,采用BCATM（PIERCE,23227,Rockford,IL,USA）蛋白定量分析檢測蛋白含量。2～20μg蛋白采用Invitrogen公司的4%～12%梯度Bis-Tris聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電轉移到0.22μm PVDF膜。已轉印的PVDF膜置5%脫脂奶粉-TBST室溫中振蕩封閉 1小時。已轉印的PVDF膜置于適當稀釋的第一抗體中4℃旋轉過夜;然后在室溫下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘;將膜置于適當稀釋的含辣根過氧化物酶標記的二抗（horseradish peroxidase-labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L）,Southern Biotech.Birmingham,Alabama 35209;或donkey anti-mouse IgG-HRP,Santa Cruz Biotech,sc-2096）的1×TBST中,室溫振蕩 1小時;室溫條件下用1×TBST洗膜三次,每次10分鐘。最后采用ECLplus化學發光底物（ECLplus,Amersham Place,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK）,具體根據使用說明書操作。用PIERCE公司X線膠片曝光記錄結果,使用Alpha Innotech Imaging system公司掃描。所用抗體如下:GHS-R1 antibody（D-16）（Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-10362,Santa Cruz,CA95060）.PhosphomTOR（Ser2448）antibody（Cell Signaling,#2971,Danvers,MA01923）,mTOR antibody（Cell Signaling,#2972）;Phospho-p70 S6 kinase（Thr389）rabbitmonoclonal antibody（Cell Signaling#9234）,Anti-p70 S6 kinase antibody（Upstate,#06-926）;Anti-phospho-ribosomal protein S6（Ser235）antibody（Upstate,#05-795）,S6 ribosomal protein（54D2）mousemAB（Cell signaling,#2317）,Phospho-4E-BP1（Ser65）antibody（Cell Signaling,#9451）,4E-BP1 antibody（Cell Signaling,#9452）;Phospho-eIF4E（Ser209）antibody（Cell Signaling,#9741）,eIF4E antibody（Santa Cruz,sc-9976）;）;Phospho-eIF4G（Ser1108）antibody（Cell Signaling,#2441）,eIF4G antibody（SantaCruz,sc-11373）。

2 結果

2.1 人T細胞表達GHSR1a T細胞富集柱分離的T細胞,采用免疫印跡法檢測,人T細胞表達GHSR1a。具體見圖1。

2.2 Ghrelin與GHSR1a結合誘導mTOR磷酸化 哺乳類雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細胞信號轉導中有重要作用,mTOR可調控正常細胞或癌細胞蛋白質合成、細胞分化和細胞體積增大。

100 ng/mlGhrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,10分鐘開始活化,30分鐘達高峰,進一步活化下游P70 S6激酶389位蘇氨酸磷酸化和活化;活化的P70 S6激酶進一步活化更下游的核糖體S6蛋白的235位絲氨酸的磷酸化和活化,見圖2。雷帕霉素則抑制Ghrelin誘導的磷酸化和活化,見圖3,表明Ghrelin誘導的信號轉導依賴mTOR的活化。

2.3 Ghrelin誘導mTOR磷酸化通過GHSR1a、PI3K和AKT 人 T細胞與 1μmol/L Des-Lys-3-GHRP6（ghrelin拮抗劑）,50μmol/L LY294002（PI3KⅠ抑制劑）,4 mmol/L 3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,PI3KⅢ抑制劑）,1μmol/LA443654（AKT抑制劑）,20 ng/m l雷帕霉素（mTOR抑制劑）37℃孵育1小時;采用Ghrelin分別治療未處理和抑制劑處理人T細胞,37℃15分鐘。采用免疫印跡檢測mTOR 2448位絲氨酸磷酸化強度,見圖3。Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和P70S6激酶389位蘇氨酸磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、LY294002、3-甲基腺嘌呤和雷帕霉素所抑制。

2.4 Ghrelin誘導mRNA翻譯起始調控分子4E-BP-1、eIF4E和eIF4G磷酸化 Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結合蛋白-1（4E-BP-1）,15分鐘開始活化,30分鐘達高峰,4E-BP-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結構結合啟動翻譯。

圖1 人T細胞表達Ghrelin受體Fig.1 Human T cells express GHSR1a

Ghrelin快速誘導eIF4E 209位絲氨酸磷酸化,5分鐘即達高峰,而eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化15分鐘則達到高峰。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于蛋白質翻譯起始,見圖4。

圖2 Ghrelin誘導人T細胞m TOR、p70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化Fig.2 Ghrelin induces phosphorylation of m TOR,p70 S6K and S6 ribosomal p rotein in human p rimary T cells

圖3 Ghrelin誘導人T細胞m TOR,P70 S6K和核糖體S6蛋白的磷酸化依賴GHSR1a,PI3K,AKTFig.3 Ghrelin-mediatedm TOR P70S6 phosphorylation isGHSR1a,PI3K,AKT dependent

圖4 Ghrelin誘導人 T細胞4E-BP-1、eIF4E和 eIF4G的磷酸化Fig.4 Ghrelin induces phosphorylation of 4E-BP1,eIF4E and eIF4G

3 討論

Ghrelin是28個氨基酸組成的多肽,其第3位絲氨酸在Ghrelin酰化酶（GOAT）作用下辛烷化,且3位絲氨酸的辛烷化對其發揮生物活性來說是必需的[7]。到目前為止,Ghrelin被中鏈脂肪酸修飾在激素中是唯一的。血清中也存在去酰化Ghrelin（Desacyl-Ghrelin）,其含量遠高于Ghrelin。正常人血清Ghrelin濃度是10～20 pmol/L,而總Ghrelin（包括Ghrelin和去酰化Ghrelin）的濃度是100～150 pmol/L,短期饑餓情況下血漿Ghrelin濃度升高,進食后血漿Ghrelin濃度降低。McCowen和Shiiya等研究表明口服或靜脈注射葡萄糖可降低血漿Ghrelin濃度;喝水則不改變血漿Ghrelin濃度。肥胖者Ghrelin濃度低而消瘦者高。腫瘤、心衰或慢性消耗性疾病所致惡病質Ghrelin濃度升高。

免疫和神經內分泌系統具有雙向調節作用,生長激素和饑餓激素Ghrelin表達于不同的免疫細胞,如T細胞、B細胞、單核細胞和中性粒細胞;免疫細胞也有生長激素受體和Ghrelin受體[8,9]。像Ghrelin作用于垂體細胞一樣,Ghrelin作用于免疫細胞表達生長激素。然而調節免疫細胞表達生長激素分泌與其他作用于垂體不同,細胞因子和絲裂原促進免疫細胞分泌生長激素,Ghrelin的生物活性包括減輕內毒素休克和抗炎作用,調節吞噬和增加胸腺生成。

mTOR是保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,在細胞信號轉導中有重要作用,mTOR可調控細胞蛋白質合成、細胞分化和細胞體積的增大[10]。mTOR對T細胞蛋白質合成也有重要作用[11]。

本文研究發現人T細胞表達Ghrelin受體,Ghrelin通過GHSR1a活化T細胞mTOR通路。Ghrelin誘導mTOR和P70 S6磷酸化可被Des-Lys-3-GHRP6、雷帕霉素、LY294002、3-甲基腺嘌呤和A443654所抑制,表明Ghrelin活化T細胞mTOR通路是通過GHSR1a、mTOR、PI3K I和 Ⅲ以及AKT。

Ghrelin誘導mTOR 2448位絲氨酸磷酸化和活化,進一步磷酸化下游mRNA翻譯抑制因子—真核翻譯起始因子4結合蛋白-1的65位絲氨酸磷酸化后,4E-BP-1與eIF4E的結合解除,4E-BP-1對eIF4E的抑制也解除,eIF4E與eIF4G和eIF4A組成復合物稱之為eIF4F,eIF4F與mRNA帽子結構結合啟動翻譯。eIF4E 209位絲氨酸磷酸化和eIF4G 1108位絲氨酸磷酸化也有助于翻譯起始。因此Ghrelin活化T細胞mTOR通路有助于蛋白質翻譯起始。

總之,Ghrelin促進人T細胞mRNA翻譯起始的機理是活化mTOR信號轉導通路,這也是第一個報道Ghrelin可在細胞水平活化mTOR信號轉導通路,將細胞代謝與免疫聯系起來。

1 Howard A D,Feighner SD,Cully D Fetal.A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormone release[J].Science,1996;273（5277）:974-977.

2 KojimaM,Hosoda H,Nakazato Metal.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach[J].Nature,1999;402（6762）:656-660.

3 Mousseaux D,LeGallic L,Ryan Jetal.RegulationofERK1/2 activity by ghrelin-activated growth hormone secretagogue receptor 1A involves a PLC/PKCepsilon pathway[J].Br JPharmacol,2006;148（3）:350-365.

4 Camina JP,LodeiroM,Ischenko Oetal.Stimulation by ghrelin of p42/p44mitogen-activated protein kinase through the GHS-R1a receptor:role ofG-proteins and beta-arrestins[J].JCell Physiol,2007;213（1）:187-200.

5 Dixit V D,Schaffer EM,Pyle RSetal.Ghrelin inhibits leptin-and activation-induced proinflammatory cytokine expression by human monocytes and T cells[J].JClin Invest,2004;114:57-66.

6 DixitV D,YangH,Sun Yetal.Ghrelin promotes thymopoiesis duringaging[J].JClin Invest,2007;117（10）:2778-2790.

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8 HattoriN.Expression,regulation and biological actionsof growth hormone（GH）and ghrelin in the immune system[J].Growth Horm IGF Res,2009;19（3）:187-197.

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10 Tobias Schmelzle,Michael N Hall.TOR,a central controller of cell growth[J].Cell,2000;103（2）:253-262.

11 Beretta L.Translational control in T lymphocytes[J].Int Rev Immunol,2004;23（3-4）:347-363.

[收稿2009-09-03 修回2009-11-29]

（編輯 許四平）

Ghrelin activates translation initiate factor in human T cells through m TOR pathway

CUITian-Pen,HUBi-Cheng.LaboratoryofClinicalImmunology,WuhanNo.1Hospital,Wuhan430022,China

Objective:Ghrelin is a brain-gut peptide with GH-releasing,apetide-inducing and anti-inflammation activities and with widespread tissue distribution.Ghrelin is the endogenous ligand of GH secretagogue receptor（GHSR）,and both ghrelin and theGHSR are expressed in T cells.We therefore examined the effectofGhrelin on human T celland its signal transduction.Methods:Ghrelin-activatingmTOR pathway in human primary T cellwas studied using immunoblotting and inhibitors of the PI3K（LY294002,3-Methyladenine）ormTOR（rapamycin）and antagonistof GHSR1a（Des-Lys-3-GHRP6）.Results:The results showed thatGHSR1a was expressed on T cells.Ghrelin caused a significant increase in the phosphorylatedmTOR,P70S6K,S6K,4E-BP-1,eIF4G,eIF4Eby immunoblotting.While the phosphorylatedmTOR,P70S6K were abolished by themTOR inhibitor rapamycin and PI3K inhibitor LY294002,3-methyladenine and alsoantagonistof GHSR1a,Des-Lys-3-GHRP6.Conclusion:The data document thatGhrelin activates translation of T cells throughmTOR pathway.

Ghrelin;mTOR;T cell;Translation

R392

A

1000-484X（2010）03-0205-05

①本課題為武漢市人事局留學回國人員創新專項資助

崔天盆（1967年-）,男,博士,副主任技師,主要從事臨床免疫學研究,E-mail:Tianpencui@hotmail.com。