卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表達載體的構建及表達鑒定

馮燕梅 羅永艾 江 濤 韓曉黎 彭 麗 吳玉蓉

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科,重慶400016)

卡氏肺孢子菌pVAX-p55-v3及pVAX-p55-v0真核表達載體的構建及表達鑒定

馮燕梅 羅永艾 江 濤 韓曉黎 彭 麗 吳玉蓉

(重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科,重慶400016)

目的:構建卡氏肺孢子菌p55-v3及p55-v0抗原基因真核表達載體,mRNA水平鑒定其在COS-7細胞中的表達。方法:以卡氏肺孢子菌總RNA為模板,RT-PCR技術擴增p55-v3及p55-v0抗原基因,連接至pTA2載體,再克隆到pVAX1真核表達載體,構建重組質粒pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0。重組質粒在感受態DH5α大腸桿菌中大量擴增后,轉染至COS-7細胞, RT-PCR鑒定其在mRNA水平的表達。結果:構建的重組質粒經酶切及測序鑒定,與文獻報道的同源性分別達到99.8%和99.9%;其編碼的氨基酸與文獻報道的同源性為100%。RT-PCR顯示p55-v3和p55-v0成功轉染至COS-7細胞,并在其中進行基因表達。結論:本研究成功構建了pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0重組質粒,并在COS-7細胞中表達,為進一步闡明p55-v3的免疫保護功能以及核酸疫苗的研究提供了基礎。

卡氏肺孢子菌;p55-v3及p55-v0;真核表達

卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)是一種涉及人和多種哺乳動物的機會感染性真菌,其中感染人的卡氏肺孢子菌已經更名為耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci,PC),它所引起的耶氏孢子菌肺炎(Pneumocystis jirovecipneumonia,PCP)是各種先天或后天免疫機能低下的患者(如艾滋病、器官移植、腫瘤放化療等)常見的并發癥和主要的死亡原因之一。近年來,由于艾滋病患者人數增加及免疫抑制劑的應用增多,PCP的發病率呈上升趨勢。因此,及時有效預防和治療PCP并進行相關的基礎研究具有重要的意義。

大鼠源P55抗原蛋白分子量為45～55 kD,它是在早期感染肺孢子菌的大鼠呼吸道中發現的一種明顯的抗原組分,能夠刺激機體產生保護性免疫反應[1,2]。近年來,Ma等[3]研究發現p55抗原基因存在多樣性,他們分別克隆了p55-v1～v4,其中p55-v3與Smulian[4]克隆的p55-v0結構上存在差異,并且定位于不同的染色體上。由于其結構和位置的不同,推測機體在感染PC的過程中,p55-v3和p55-v0刺激宿主免疫反應時可能發揮了不同的作用。本文通過對上述兩種抗原基因進行擴增、克隆、序列分析,并在COS-7細胞中對其表達效率進行研究,有利于進一步闡明p55-v3的免疫保護功能,從而為闡明PC與宿主相互作用的分子機制及新型疫苗的研制提供基礎,為PCP防治提供一種新的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產品。RNAisoTMPlus,RT-PCR試劑盒(兩步法),限制性內切酶 K pnⅠ、ApaⅠ及T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;DNA膠回收試劑盒及Bio MarkerⅢ購自BioFlux公司;PCR純化試劑盒購自北京蓋寧生物科技有限公司;其它試劑均為進口或國產分析純試劑。

1.2 動物模型 根據文獻[5]報道清潔級雌性SD大鼠,體重200克左右(由重慶醫科大學動物實驗中心提供),注射地塞米松誘導PCP,建立動物模型。

1.3 質粒、菌株及細胞 TA rget cloneTM-Plus-購自TOY OBO公司。真核表達載體pVAX1購自Invitrogen公司。感受態大腸桿菌DH5α購自北京鼎國生物技術有限公司。COS-7細胞由重慶醫科大學生命科學院提供。

1.4 引物的設計和合成 根據p55-v0和p55-v3的基因序列CDS區設計引物。運用Primer5.0和Oligo6.0分析引物的可行性,用Blastn對其同源性進行

1.5 總RNA的提取 取病原學確診的重度PC感染的肺組織約50 mg,按RNAisoTMPlus試劑說明書抽提總RNA。用核酸蛋白定量檢測儀測定RNA濃度及OD260/OD280,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。

1.6 p55-v3和p55-v0基因擴增及亞克隆 按照試劑盒說明書進行兩步法RT-PCR反應,反應體系為50μl。p55-v3及p55-v0反應條件均為94℃預變性5分鐘,94℃變性30秒,55℃延伸30秒,72℃延伸60秒,共35個循環。最后72℃延伸5分鐘。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物按膠回收試劑盒說明書進行膠回收后與T載體連接。PCR產物2μl,pTA2 vector 1μl,2×ligation Buffer 5μl,T4 DNA Ligase 1μl,雙蒸水補足10μl,室溫反應30分鐘。然后用制備好的感受態大腸桿菌DH5α進行轉化。將10μl連接液加入感受態細胞(200μl)中輕輕混勻后冰浴30分鐘,42℃熱休克30秒,冰浴冷卻2分鐘。加SOC培養基900μl,于37℃振動培養1小時。取適量涂于LB/AP/IPTG/X-gal板上,于37℃過夜培養。通過藍白判定挑出白色重組菌落接種于抗Amp的LB培養液中37℃,200 r/min震蕩培養12小時。次日取1μl菌液PCR鑒定(條件同前),同時用質粒抽提試劑盒抽提質粒后用K pnⅠ及ApaⅠ進行酶切鑒定。取陽性重組質粒送sangon測序鑒定并運用DNAstar軟件分析測序結果。

1.7 真核表達載體的構建及鑒定 分別將測序正確的重組載體pTA-p55-v3、pTA-p55-v0及pVAX1用K pnⅠ及ApaⅠ進行雙酶切,酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后運用膠回收試劑盒及PCR產物純化試劑盒回收大小分別約1 054 bp、1 253 bp及3 000 bp的DNA片段。分別將酶切后的p55-v3、p55-v0與回收的pVAX1片段用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α,運用卡那霉素(50μg/ml)作為抗性陽性篩選,挑取陽性克隆擴增并小量提取質粒DNA。對質粒DNA進行PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.8 轉染COS-7細胞并檢測目的基因mRNA的表達COS-7細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEMF12中,于轉染前24小時收集細胞并接種于50 ml培養瓶中,細胞密度為3×105ml-1,在37℃,5%CO2條件下培養24小時,使每瓶細胞密度達到90%左右。與此同時根據無內毒素質粒抽提試劑盒說明書抽提質粒pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0及pV AX1,然后運用LipofectamineTM2000轉染所抽提質粒,轉染后24小時運用RT-PCR法檢測目的基因mRNA的表達,目的基因及內參(G APDH)PCR條件同前。

2 結果

2.1 PC總RNA的提取 提取的總RNA經核酸蛋白定量檢測儀測定濃度為 2.045μg/μl,OD260/ OD280為1.937,1%瓊脂糖凝膠電泳5S、18S、28S三條帶均可見(圖1),說明總RNA達到實驗要求,可以進行RT-PCR。

2.2 p55-v3和p55-v0基因的克隆 以PC總RNA的反轉錄產物cDNA為模板,分別加入特異性引物P1、P2和P3、P4,所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析分別在1200bp、1000bp左右處可見一特異性條帶,與預期大小相符(圖2)。將片段克隆入pTA2載體,獲得陽性重組克隆pTA-p55-v3、pTA-p55-v0,PCR及雙酶切鑒定結果所得質粒為重組載體(圖3、圖4)。經測序及DNAstar軟件分析所得兩個重組載體分別為p55-v3、p55-v0抗原基因片段,p55-v0兩個堿基發生突變,210位C-G、475位A-G。p55-v3一處堿基發生突變,1 021位T-C,與文獻報道的同源性分別達到99.8%和99.9%;其編碼的氨基酸與文獻報道的同源性為100%。而p55-v3和p55-v0之間的同源性為20.9%。

圖1 PC感染鼠肺組織總RNAFig.1 Total RNA of lung tissues from PC infected rat

圖2 p55-v0及p55-v3基因RT-PCR擴增產物的鑒定Fig.2 Identification of RT-PCR product of p55-v0 and p55-v3 gene

2.3 pV AX1-p55-v3和pV AX1-p55-v0真核表達載體的構建 將pT A-p55-v3、pT A-p55-v0重組質粒用K pnⅠ、ApaⅠ雙酶切,獲得p55-v3、p55-v0抗原基因片段,再將其克隆至真核表達載體pV AX1,構建重組載體pV AX-p55-v3、pV AX-p55-v0,經酶切鑒定表明p55-v3、p55-v0抗原基因片段已成功克隆入pV AX1載體(圖5)。

2.4 RT-PCR鑒定重組載體在COS-7細胞中的表達

pVAX-p55-v0、pVAX-p55-v3及空質粒轉染COS-7細胞后24小時,提取總RNA,進行RT-PCR,1%瓊脂糖凝膠電泳觀察(圖6)可見重組質粒轉染組(泳道1、2)有明顯的特異性條帶,分別位于1 200 bp及1 000 bp左右,其大小與p55-v0及p55-v3基因片段一致,而空質粒轉染組僅見內參(G APDH)條帶,未見特異性條帶。表明重組質粒轉染組的p55-v0及p55-v3基因在COS-7細胞中有表達。

圖3 重組質粒pTA-v0、pTA-v3的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 by PCR

圖4 重組質粒pT A-v0、pT A-v3的KpnⅠ、ApaⅠ雙酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pTA-v0/pTA-v3 digested with KpnⅠand ApaⅠ

圖5 重組真核表達載體pVAX-p55-v3、pVAX-p55-v0的酶切鑒定Fig.5 Identification of recombinant eukaryotic expression vector pVAX-p55-v3,pVAX-p55-v0 by enzyme digesting

圖6 轉染COS-7細胞mRNA水平的表達Fig.6 mRNA expression of the transfected COS-7 cells

3 討論

PC免疫診斷和免疫預防、治療的關鍵問題是抗原。而由于PC培養困難,很難成批供應大量高純度的PC抗原蛋白,同時由于PC抗原成分復雜,抗原變異較大,因此利用DNA重組技術制備大量高純度抗原,對于免疫診斷、預防和治療均具有重要意義。

P55是卡氏肺孢子菌細胞壁上的一種組分抗原。Smulian等[2,4]克隆并鑒定了肺孢子菌55 kD抗原基因(p55-v0),將重組P55-V0抗原主動免疫大鼠后能夠刺激機體產生體液免疫和細胞免疫反應。Ma等[3]克隆了p55-v3基因(GenBank:AY768940),通過比較發現p55-v3和p55-v0基因5′端存在較大差異,3′端均為高度保守區域但兩者重復區域的氨基酸種類和數目存在差異;p55-v0包含一個N-連接糖基化位點和RG D連接位點而p55-v3卻沒有;同時染色體雜交發現p55-v3主要位于第4染色體而p55-v0主要位于第2染色體。然而P55-V3是否和P55-V0一樣能對宿主產生保護性免疫反應及其作用機制如何,目前尚不是很清楚。

pVAX1是目前唯一符合FDA標準的哺乳動物細胞表達載體。它是一種分子量為3.0kb的真核表達載體。其Kan選擇抗性和多克隆酶切位點能夠克隆大片段目的基因。啟動子CMV和BGH polyA信號可以在哺乳動物細胞中高表達重組蛋白。迄今為止,關于pVAX1的研究已經廣泛涉及到臨床各個方面[6-8]。本研究克隆了p55-v3和p55-v0基因,并構建pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0真核表達載體,轉染COS-7細胞,RT-PCR在mRNA水平檢測其表達。結果發現pVAX-p55-v3和pVAX-p55-v0轉染組能擴增出相應的基因片段,而空載體組不能,表明p55-v3和p55-v0基因片段在真核細胞內RNA水平有轉錄。這為進一步研究p55-v3的免疫功能,比較p55-v3和p55-v0的免疫作用機制以及PC DNA疫苗的研究提供了基礎。

致謝:本研究得到美國NIH馬良博士的指導,特此感謝!

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2 Smulian A G,Sullivan D W,Theus S A.Immunization with recombinant Pneumocystis carinii p55 antigen provides partial protection against infection:characterization of epitope recognition associated with immunization [J].Microbes Infect,2000;2(2):127-136.

3 Ma L,Kutty G,Jia Qet al.Characterizationof variantsof the gene encoding the p55 antigen in Pneumocystis from rats and mice[J].J Med Microbiol,2003;52(Pt 11):955-960.

4 Smulian A G,Theus SA,Denko Net al.A 55 kDa antigenof Pneumocystis carinii:analysis of the cellular immune response and characterization of the gene[J].Mol Microbiol,1993;7(5):745-753.

5 張 帆,盧思奇,王鳳云 et al.卡氏肺孢子蟲低死亡率sd大鼠動物模型的建立[J].中國寄生蟲病防治雜志,2005;18(2):99-102, F002.

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[收稿2009-10-19 修回2009-11-19]

(編輯 倪 鵬)

Construction and identification of pneumocytis cariniieukaryotic expression plasmids of pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 antigenic gene

FENG Yan-Mei,LUO Yong-Ai,JIANG Tao,HAN Xiao-Li,PENGLi,WU Yu-Rong.Department of Respiratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China

Objective:T o construct eukaryotic expression plasmids ofpneumocystis cariniip55-v3 and p55-v0 antigenic genes and to identify their expression in COS-7 cells at mRNA level.Methods:Pneumocystis cariniitotal RNA was used as the template to amplify p55-v3 and p55-v0 antigenic gene by RT-PCR.The products were connected to pTA2 vector and then cloned in pVAX1 eukaryotic expression vector to construct recombinant plasmids as pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0.After propagated inE.coliDH5α,the recombinant plasmids were transfected into COS-7 cells.After 24 h incubation,the RT-PCR was performed to identify the mRNA expression of p55-v3 and p55-v0 antigenic gene.Results:The recombinant plasmids were qualified by restrictive endonuclease digestion and sequencing.And when compared with that in GenBank,the homologyof p55-v3 antigenic gene was 99.9%in nucleotides and 100%in amino acid.The homology between p55-v0 antigenic gene and the one reported previously in nucleotide and amino acid seguence were 99.8%and 100%.The results of RT-PCR confirmed that p55-v3 and p55-v0 antigenic geneswere transfected into COS-7 cells successfully and the geneswere expressed in the cells.Conclusion:In this study,the recombinant plasmidsof pVAX-p55-v3 and pVAX-p55-v0 are conducted successfully and expressed in the COS-7 cells,which provide a basis for clarification of immunologic function of p55-v3 and study of DNA vaccine.

Pneumocystis carinii;p55-v3 and p55-v0;Eukaryotic cell expression

R379.9 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)03-0214-04

馮燕梅(1982年-),女,在讀博士,主要從事卡氏肺孢子菌肺炎免疫治療方面的研究,E-mail:gg-mm@126.com;

及指導教師:羅永艾(1942年-),男,教授,博士生導師,主要從事免疫治療方面的研究;E-mail:luoyongai1942@163.com。