慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的相關研究

巫翠萍 覃 西 王華民 巫翠云 李文廣 林 丹 朱 洪 李 一

（海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院,海口 570102）

慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的相關研究

巫翠萍 覃 西 王華民①②巫翠云③李文廣 林 丹 朱 洪 李 一①

（海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院,海口 570102）

目的:探討慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的含量和CD4+CD8+T淋巴細胞亞群分布,兩者之間相關性及與HBV的相關性。方法:采用流式細胞術檢測50例慢性乙型肝炎患者和20例健康對照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞表達及CD3/CD4/CD8T淋巴細胞亞群,熒光定量PCR法檢測HBV DNA含量。結果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明顯高于健康對照組（P＜0.01）,且隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細胞的水平逐漸升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞也相應增高,且與CD4+CD25highTreg細胞的變化成正相關（r=0.890,P＜0.001）。與健康對照組比較,患者組CD4+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T細胞和CD8+T細胞百分率差異無顯著性（P＞0.05）。CD4+CD25highTreg細胞與HBV DNA取對數(shù)后成正相關（r=0.782,P＜0.001）,與谷丙轉氨酶（ALT）成正相關（r=0.432,P＜0.005）;與 CD3+、CD4+、CD8+T細胞水平及CD4+/CD8+比值均無相關性（P＞0.05）。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值與HBV DNA載量之間亦無相關性（P＞0.05）。結論:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞增高,且與HBV的復制水平及ALT增高具有一致性,而T細胞亞群是否可作為監(jiān)測CHB患者免疫狀態(tài)的指標需進一步探討。

CD4+CD25+調節(jié)性T細胞;慢性乙型肝炎;T淋巴細胞亞群

乙型肝炎的肝細胞損傷主要是通過機體一系列的免疫介導所造成,其中以T細胞免疫為主。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（regulatory T cell,Treg）是近十年發(fā)現(xiàn)的T細胞亞群,具有抑制效應T細胞功能的作用。有研究資料表明,其與慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）的發(fā)生機制可能相關,但目前對慢性乙型肝炎患者外周血中Treg的頻率報道并不一致[1,2],且國內外對慢性乙型肝炎中的觀察僅限于其外周血中CD4+CD25+Treg的變化,很少結合與其T細胞亞群關系和HBV感染狀況的觀察。本研究對乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg、CD4+CD8+T淋巴細胞亞群以及HBV DNA的表達水平和肝功能指標及其相關性進行了觀察分析,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 2007年12月至2008年7月在海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院收治并臨床診斷的慢性乙型肝炎患者50例,其中男性34例,女性16例,年齡 20～75歲,平均年齡（39.10±16.71）歲。診斷標準符合2000年中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》[3]。所有病例均排除其他肝炎病毒感染和自身免疫性疾病,藥物、酒精性肝炎等。健康對照組20例,男性13例,女性7例,年齡22～ 61歲,平均年齡（37.50±9.74）歲,為我院健康體檢者,無肝炎病史,血清乙型肝炎標志物均陰性,肝功能指標均正常。所有病例及對照組均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 美國Bectond-Dickinson公司生產(chǎn)的FACS Calibur型流式細胞儀;抗CD3-PerCP、抗CD25-PE、抗 CD4-FITC、抗 Foxp3-APC及同型對照、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4APCT細胞亞群試劑盒均購自美國Bectond-Dickinson公司;HBV DNA定量PCR試劑盒由中山醫(yī)科大學達安基因股份有限公司提供,儀器為美國PE公司5700型DNA擴增儀;肝功能檢測試劑盒由廣州標佳試劑有限公司提供,儀器為美國 Beckman Coulter公司生產(chǎn)的LX20型全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞儀檢測CD4+CD25highTreg細胞及胞內Foxp3和T淋巴細胞亞群 取兩份新鮮采集的EDTA抗凝血各50μl分別置于不同的管中,分別加入抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗CD25-PE及抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗IgG1-PE各15μl,室溫避光孵育20分鐘,加入2 ml溶血素室溫避光10分鐘,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 2ml洗滌1次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 250μl,上機使用CELLQuest軟件進行檢測,參照文獻[4]選擇熒光強度＞102的CD4+CD25high作為Treg細胞。記錄陽性細胞百分率,減去非特異性對照值。Foxp3胞內染色時先進行細胞表面抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗CD25-PE染色20分鐘,加入2 ml溶血素室溫避光10分鐘,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,再加入破膜劑1m l避光10分鐘,破膜洗滌液洗滌2次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,分別加入抗Foxp3-APC及同型對照抗IgG1-APC各15μl,避光孵育30分鐘,加入PBS 2m l洗滌1次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 250μl,上機使用CELLQuest軟件檢測分析,以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-FITC定義CD4+T 細胞,計算這細胞群內 CD25+Foxp3+細胞的比率。檢測CD3FITC/CD8PE/CD45Per-CP/CD4PE淋巴細胞亞群時另取新鮮采集的EDTA抗凝血50μl加入20μl試劑中,室溫避光孵育15分鐘,加入450μl溶血素,室溫避光10分鐘,上機使用MultiSET軟件獲取細胞并進行分析。

1.3.2 慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA的定量檢測 采用熒光定量PCR法,操作嚴格按照試劑說明書進行,檢測閾值為103copies/ml,HBV DNA＜1×103copies/m l為陰性結果。

1.3.3 肝功能檢測 使用全自動生化分析儀,操作嚴格按照試劑說明書進行。項目包括谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、γ谷氨酰轉肽酶、總膽紅素、直接膽紅素、總膽汁酸、總蛋白、白蛋白、球蛋白、前白蛋白共12項。

2 結果

2.1 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg表達水平 慢性乙型肝炎組CD4+CD25highTreg細胞占CD4+T細胞比例為（5.0±0.5）%,明顯高于健康對照組（3.9±0.8）%,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01,表1、圖1）。進一步分析,根據(jù)HBV DNA載量的不同,將慢性乙型肝炎患者分為高載量組（HBV-DNA≥105copies/m l）,低載量組（HBV-DNA＜105copies/ml）,陰性組（HBV-DNA＜103copies/ml）。結果顯示隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細胞的水平升高,高載量組、低載量組和陰性組CD4+CD25highTreg細胞的表達水平分別為（5.7±0.6）%、（4.9±0.6）%和（4.3±0.5）%,高載量組均明顯高于低載量組和陰性組（P＜0.01）;低載量組高于陰性組（P＜0.01）,HBV DNA陰性組的CD4+CD25highTreg細胞高于對照組,但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表2。

2.2 慢性乙型肝炎患者外周血Foxp3+Treg表達水平 Foxp3是CD4+CD25highTreg細胞的一個特征性標志。為證實在慢性乙型肝炎患者外周血中增高的CD4+CD25highTreg屬于T調節(jié)細胞,我們同時檢測了慢性乙型肝炎患者外周血中Foxp3的表達水平。慢性乙肝組和健康對照組CD4+CD25+Foxp3+表達率分別為（3.9±0.6）%和（2.9±0.5）%,慢性乙型肝炎組明顯高于正常對照組（P＜0.01,表1）。進一步分析,隨 HBV DNA載量增加,患者外周血中Foxp3+Treg細胞的水平升高,高載量組、低載量組和陰性組Foxp3+Treg細胞的表達水平分別為（4.5±0.4%）、（3.9±0.5）%和（3.2±0.5）%,高載量組均明顯高于低載量組和陰性組（P＜0.01）,低載量組高于陰性組（P＜0.01）,陰性組與健康對照組比較無明顯差異（P＞0.05）,見表2。

2.3 慢性乙型肝炎患者CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞亞群的變化 與健康對照組比較,患者組CD4+T細胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,分別為（28.5%±6.1%vs 33.6%±4.2%）及（1.12%±0.4%vs 1.4%±0.4%）,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;而CD3+T細胞和CD8+T細胞的百分率分別為（62.4%±9.2%vs 62.8%±7.4%）和（26.9%±6.4%vs 25.8%±6.2%）,與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。高載量組、低載量組和陰性組CD4+T細胞百分率均低于健康對照組（P＜0.05）,但各載量組之間無明顯差異（P＞0.05）,高載量組和低載量組 CD4+/CD8+比值均低于正常對照組（P＜0.05）,而陰性組與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）;CD3+T細胞和CD8+T細胞百分率在各載量組無顯著性差異（P＞0.05）,見表2。

表1 慢性乙型肝炎患者外周血Treg及CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞亞群檢測結果（%）Tab.1 Testing results of Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood of CHB patients（%）

表2 HBV-DNA不同載量的慢性乙型肝炎患者外周血Treg及CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞亞群檢測結果（%）Tab.2 Testing results of Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheral blood of CHB patients with various copies of HBV DNA（%）

圖1 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25high Treg細胞水平與健康對照組比較Fig.1 Comparision of the level of CD4+CD25high Tregs in peripheralblood between CHB patients and healthy controls

圖2 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與Foxp3+Treg細胞成正相關Fig.2 Positive correlation between CD4+CD25+Tregs and Foxp3+Tregs in peripheral b lood of CHB patients

圖3 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與HBV DNA取對數(shù)后呈正相關Fig.3 The number of CD4+CD25+Tregs correlated positively with logarithm of HBV DNA copies in peripheral blood of CHB patients

圖4 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細胞水平與ALT成正相關Fig.4 The level of CD4+CD25+Tregs correlated positively with that of ALT in peripheral blood of CHB patients

2.4 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg水平與 CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD3+CD4+CD8+T淋巴細胞亞群、HBV DNA載量的關系 對50例慢性肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg細胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞、T淋巴細胞亞群、HBV DNA載量之間采用Pearson直線相關分析,CD4+CD25highTreg細胞的變化與CD4+CD25+Foxp3+Treg水平變化成正相關（r=0.94,P＜0.001）;與HBV DNA取對數(shù)后成正相關（r=0.88,P＜0.001）;與 CD3+、CD4+、CD8+T細胞的表達水平及CD4+/CD8+比值均無相關性（P＞0.05）,而CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞及CD4+/CD8+比值與HBV DNA載量之間亦無相關性（P＞0.05）。見圖2、圖3。

2.5 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg水平與肝功能指標的相關性 將CD4+CD25highTreg水平與肝功能檢測指標做相關性分析,發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highTreg水平與谷丙轉氨酶（ALT）成正相關（r=0.432,P＜0.005）,見圖4。

3 討論

不同個體在HBV感染后的免疫學和臨床轉歸不同,這與宿主的人類白細胞抗原（Human leukocyte antigens,HLA）等遺傳學背景、HBV自身特性和細胞免疫應答均相關。在慢性乙型肝炎患者,HLA-1限制性的針對HBV各類抗原表位的特異性細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）應答常常不足或十分微弱,是肝細胞內HBV不易清除,病情遷延不愈的重要機制之一[5]。而近年來的研究證實CD4+CD25+Treg細胞對CTL免疫應答有調控作用,與乙型肝炎發(fā)病密切相關[1,2]。Treg細胞具有免疫無能性和免疫抑制性,在低濃度IL-2刺激下不反應,但在高濃度IL-2條件下經(jīng)TCR激活后可活化或增殖,抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞IL-2的轉錄和表達,從而干擾其活化與增殖,而且對CD8+細胞的殺傷功能有明顯抑制[6,7]。Stoop等[2]發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量較正常人增多,去除CD4+CD25+Treg細胞后,HBV特異性增殖反應增強。Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血中Treg細胞的水平明顯升高,且Treg細胞水平與其病毒載量呈正相關,分離得到的Treg細胞具有誘導形成HBV抗原特異性Treg的能力,HBV抗原特異性Treg則促進了HBV感染的慢性化。我們的研究結果也表明,CHB患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞明顯高于健康對照組,且隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細胞的水平亦升高。提示CD4+CD25+Treg細胞引起細胞免疫反應下降,從而導致機體不能徹底有效清除病毒。

CD4+CD25highTreg作為天然調節(jié)性T細胞,是Treg的主要組成成分。叉頭狀/翅膀狀螺旋轉錄因子（forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3）是調節(jié)性T細胞比較特異的標志,特異性表達于小鼠Treg[9],而且在人胸腺和外周血及臍帶血中均分離出CD4+CD25+Foxp3+細胞[10]。Foxp3與調節(jié)性T細胞的功能密切相關,是目前定義CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的最佳標志物[11]。因此我們同時檢測CHB患者外周血中CD4+CD25highTreg細胞及其胞內Foxp 3的表達,證實患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的水平變化與CD4+CD25highTreg細胞的數(shù)量改變相平行,且兩者之間成正相關。

研究CD4+CD25highTreg細胞水平與HBV DNA載量及ALT的水平關系發(fā)現(xiàn),CD4+CD25highTreg細胞水平與HBV DNA載量及ALT的水平之間均存在明顯的相關性。說明Treg細胞的免疫抑制效應促進了HBV病毒的復制,從而加重肝功能的損害。動物實驗已經(jīng)證實[12],如果預先清除小鼠體內的CD25+T細胞,通過基因治療后的小鼠體內針對HBV特異性的效應CD8+T細胞數(shù)量顯著升高。體外實驗表明,Treg可以抑制細胞增殖和IFN-γ分泌[4]。因此如果能將特異性阻斷CD4+CD25highTreg的方法和增強機體特異性抗HBV的免疫功能手段有機結合,也許能抑制HBV的復制,提高CHB的治療效果。

T細胞亞群是目前臨床上最常用的反映免疫功能狀態(tài)的指標,我們同時檢測了CHB患者的T淋巴細胞亞群,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CHB患者CD4+T細胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值均降低,差異有統(tǒng)計學意義,CD8+T淋巴細胞雖有增高的趨勢,但與對照組比較無明顯差異。該結果提示 CHB患者外周血CD4+T細胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值降低,顯示機體T淋巴細胞數(shù)量異常,免疫功能低下,可促進病毒的復制。其原因可能與其體內Treg細胞含量較高有關系,Treg細胞抑制了CD4+T細胞的活化增殖和細胞因子的分泌,從而影響機體抗感染免疫應答的發(fā)生,導致感染的持續(xù)。先前有報道CHB患者機體特異性的CD8+T細胞反應減弱是HBV慢性感染狀態(tài)持續(xù)存在的主要原因[13]。但我們的結果顯示CHB組CD3+T細胞和CD8+T細胞的百分率與對照組比較差異無顯著性。CD4+、CD8+、CD3+T細胞數(shù)量及CD4/CD8比值在HBV DNA各載量組之間均無明顯差異,且與HBV的復制水平均無明顯相關性?？赡苁且驗椴±龜?shù)較少,亦可能是CD4+T細胞和CD8+T細胞各自包含了很多功能各異的細胞群體,因此 T細胞亞群不能全面反映機體的免疫功能狀態(tài)。

本研究還發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highTreg細胞與CD3+、CD4+、CD8+T細胞的表達水平之間均無明顯的相關性,其確切原因不清楚,我們認為慢性乙型肝炎患者體內的T細胞調節(jié)是一個多因素參與的過程,CD4+及CD8+T細胞的抑制可能受多種途徑多種因素調控,CD4+CD25+Treg細胞只是其中一種。

綜上所述,CD4+CD25+Treg可能參與了慢性乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展,CD4+CD25+Treg細胞與HBV的復制水平及ALT增高具有較好的一致性,可能是一個較好的反映細胞免疫功能狀態(tài)的參考指標,有望在臨床上用于免疫功能的監(jiān)測,而T細胞亞群是否可作為監(jiān)測CHB患者免疫狀態(tài)的指標需進一步探討。

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2 Stoop JN,van der Molen RG,Baan C Cetal.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patientswith chronic hepatitis B virus infection[J].Hepatology,2005;41（4）:771-778.

3 中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲學會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華內科雜志,2001;40（1）:62-68.

4 福軍亮,徐東平,趙 平etal.急慢性乙型肝炎患者外周血調節(jié)性T細胞鑒定與臨床意義分析[J].中華醫(yī)學雜志,2006;86（22）:1522-1525.

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11 Fontenot JD,Rudensky AY.Awell adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forkhead fam ily transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005;6:331-337.

12 Furuichi Y,Tokuyama H,Ueha Setal.Depletion ofCD25+CD4+T cell（Tregs）enhances the HBV-specific CD8+T cell response primed by DNA immunization[J].World JGastroenterol,2005;11:3772-3777.

13 徐慧寧,姜艷芳,牛俊奇.CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在慢性乙型肝炎中的研究進展[J].中國老年學雜志,2008;28（3）:306-308.

[收稿2009-04-25 修回2009-12-21]

（編輯 倪 鵬）

Study on CD4+CD25+regulatory T cells and CD4+,CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood of patientsw ith chronic hepatitis B

WUCui-Ping,QINXi,WANGHua-Min,WUCui-Yun,LiWen-Guang,LINDan,ZHUHong,LIYi.DepartmentofLaboratoryMedicine,HainanMedicalCollege,Haikou570102,China

Objective:To investigate thequantificationof CD4+CD25+regu latory T cellsand distributionof CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheral blood of patients in chronic hepatitis B（CHB）,and to reveal relationship between CD4+CD25+regulatory T cells,CD4+CD8+T lymphocyte subgroup and HBV infetion aswell.Methods:CD4+CD25high,CD4+CD25+Foxp3+Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood from 50 patientswith CHB and 20 healthy controlswas analyzed using flow cytometry.HBV DNA was detected by fluorescence quantitative PCR.Results:The numberof CD4+CD25highTregs in patientswith CHBwas obviously higher than that in healthy controls（P＜0.01）and increased with copies of HBV DNA.The same with the change ofCD4+CD25+Foxp3+Tregs in patientswith CHB and therewasa positive correlation between CD4+CD25highTregs and CD4+CD25+Foxp3+Tregs（r=0.890,P＜0.001）.Comparedwith healthy controls,the frequency of CD4+T cells and the ratio of CD4+/CD8+in patientswith CHBwas declined,but therewas no significant difference in the frequency of CD3+T cells and CD8+T cells between them（P＞0.05）.The variation in the number of CD4+CD25highTregs was correlated positivelywith the copies of HBV DNA（r=0.782,P＜0.001）and glutam ic-pyruvic transaminase（ALT）（r=0.432,P＜0.005）separately,butnegatively with the frequency ofCD3+,CD4+,CD8+T cells and the ratio of CD4+/CD8+（P＞0.05）.The variation in the frequency of CD3+,CD4+,CD8+T cells and the ratio of CD4+/CD8+was also correlated negatively with the copies of HBV DNA（P＞0.05）.Conclusion:The number of CD4+CD25highTregs increases in patientswith CHB and is in accordance with the copies of HBV DNA and increased level of ALT.Further studies should be done to investigate weather CD4+CD8+T lymphocyte subgroup could be used to monitor the stateof community.

CD4+CD25+Treg;Chronic hepatitis B;T lymphocyte subgroup

R392.9

A

1000-484X（2010）03-0273-05

①吉林大學白求恩醫(yī)學院,長春130012

②同時就職于海南醫(yī)學院檢驗系,海口571101

③?？谑腥嗣襻t(yī)院,?？?70208

巫翠萍（1962年-）,女,副主任檢驗師,主要從事流式細胞術的應用及研究,E-mail:wucuiping2007@163.com;通訊作者及指導教師:覃 西（1959年-）,女,教授,主要從事臨床血液學和免疫學檢驗研究,E-mail:qinxi99@21cn.com。