人Argonaute2蛋白多克隆抗體制備及初步應用①

李海芳 浦 永 湯石明 強 冉 湯 華

(天津醫科大學基礎醫學院天津市生命科學中心實驗室,天津300070)

·免疫學技術與方法·

人Argonaute2蛋白多克隆抗體制備及初步應用①

李海芳 浦 永 湯石明 強 冉 湯 華

(天津醫科大學基礎醫學院天津市生命科學中心實驗室,天津300070)

目的:制備人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗體,鑒定其特異性,并應用該抗體檢測Ago2在人各細胞系中的表達差異及細胞定位。方法:用DNAstar軟件尋找抗原性高的Ago2序列區域(命名為k-Ago2),構建k-Ago2的表達質粒,轉化大腸桿菌并誘導表達。融合蛋白經切膠回收純化后免疫大白兔制備抗體。以ELISA檢測抗體效價,Western blot鑒定抗體特異性及檢測Ago2在細胞系中的表達差異,免疫熒光染色觀察Ago2的細胞定位。結果:成功構建表達質粒,繼而k-Ago2得以表達與純化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗體。ELISA檢測抗體效價為1∶19 000,Western blot確定抗體具有高度特異性,并成功地用該抗體檢測到Ago2在人各細胞系中的表達差異及細胞定位。結論:Ago2多克隆抗體的成功制備,對RNAi機制的深入研究及其進一步的臨床應用均具有重要價值。

Argonaute2蛋白;多克隆抗體;RNA干擾;RNA誘導沉默復合體

[Abstract]NA干擾(RNA interference,RNAi)是由小RNAs介導,在幾乎所有真核生物中存在的保守的基因調節機制[1-3],可以使同源靶mRNA降解或者翻譯抑制進而使基因表達抑制或沉默[4],在生物體抗病毒感染、腫瘤發生、生物發生發育時序的控制、脂肪代謝、血細胞分化、細胞生長和凋亡等過程中發揮著重要的作用[5]。在RNAi過程中,小RNAs與Argonaute (AG O)蛋白形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC),并引導RISC識別互補的靶序列引發不同的沉默效應,而其中AG O蛋白是RISC的核心部分[6,7]。并且實驗報道顯示只有Ago2蛋白是人類AG O蛋白家族(Ago1-4)中已知的唯一在RNAi起作用的成員,它與小RNAs即可構成最簡單的效應器對完全互補的靶mRNA進行剪切[8-10]。因此,在哺乳動物的RNAi中,Ago2是特異的并具有非常重要的作用[11]。本研究尋找抗原性強的Ago2蛋白片段進行原核表達、純化、成功制備Ago2抗體并以該抗體進行了初步應用,為進一步深入了解RNAi參與人類諸多疾病的基本生物學機制及RNAi在臨床上的應用起到了基礎性作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Argonaute2蛋白全長表達質粒pCDNA3 myc/Ago2,原核表達載體pRSET A2(由本實驗室在pRSETA基礎上改建而成,將EcoRⅠ和XhoⅠ位點調換),大腸桿菌X L1-Blue、BL21(DE3),所用細胞系均由本實驗室保存。引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成;測序由北京華大基因提供;Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、標準蛋白marker購自Ferments公司;各種限制性內切酶購自TaKaRa公司;弗氏完全佐劑(FCA)及弗氏不完全佐劑(FICA)購自Sigma公司;DNA marker、日本大耳白兔、抗His抗體、抗myc抗體、抗 G APDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG購自賽爾生物科技有限公司;異硫氰酸(FITC)標記的驢抗兔IgG購自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化學試劑均為分析純以上產品。

1.2 方法

1.2.2 原核表達質粒的構建 PCR回收產物和pRSETA2空載體以EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,37℃水浴過夜后,進行瓊脂糖(10 g/L)凝膠電泳并回收,然后在T4 DNA連接酶作用下室溫連接4小時,轉化E.coliX L1-Blue,通過氨芐青霉素(Amp+)抗性篩選得到重組子。挑取陽性克隆小提質粒DNA并酶切鑒定。

1.2.3 融合蛋白的誘導表達 鑒定正確的質粒轉化 E.coliBL21(DE3),涂布于Amp+抗性的LB平板37℃過夜培養。然后挑取單克隆于2 ml LB中,37℃振蕩培養過夜。次日接種培養物到10 ml LB中, 37℃振蕩培養約2小時,至A600=0.5～0.7。取1 ml作為誘導前對照,其余的加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L,30℃繼續振蕩培養4小時。離心收集菌體,其中誘導后菌體加入磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后超聲裂解,離心取上清,在其沉淀即重組蛋白形成的包涵體中加入Buffer B(100 mmol/L NaH2PO4, 10 mmol/L Tris·Cl,8 mol/L urea,pH8.0)裂解,再次離心取上清。誘導前對照組菌體則直接加入Buffer B裂解后離心取上清。將各管上清取部分加入上樣緩沖液水浴煮沸5分鐘,冰置5分鐘進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色分析。

1.2.4 融合蛋白的切膠回收純化 將表達融合蛋白的菌液轉接到150 ml LB中擴大培養,并按上述條件誘導表達和裂解菌體。將包涵體裂解所得上清加入上樣緩沖液處理后進行SDS-PAGE電泳,根據溴酚藍位置推測目的蛋白位置。結束電泳后,將膠放入0.25 mol/L KCl溶液中在搖床上搖動約15分鐘,目的蛋白可呈現一條白色的條帶,將條帶切下后裝入密封的透析袋(內裝滿PBS),以1×Tris-甘氨酸(不含SDS)緩沖液為電泳液進行水平電泳。120 mA恒流電泳2小時后對換陰陽極后再電泳3分鐘,然后留取透析袋內的PBS緩沖液并取部分上樣進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 兔多克隆抗體的制備 取200μg蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1比例混合后皮下注射初次免疫兔子,以后每間隔2周,取200μg蛋白與弗氏不完全佐劑按1∶1比例混合加強免疫2次,1周后兔耳緣靜脈取血檢測抗體效價并加強免疫1次,如達到所需效價7天后取全血,分離血清后,無菌分裝保存于-20℃。

1.2.6 間接ELISA法檢測抗體效價 以終濃度為1 mg/L的目的蛋白包被ELISA反應孔,一抗是作為空白對照的PBS、陰性對照的免疫前兔血清以及倍比稀釋的抗目的蛋白抗體,二抗為HRP-羊抗兔IgG (1∶20 000),最后加入底物顯色后,用酶標儀測定A450的值。結果以實驗組值-空白對照/陰性對照-空白對照≥2.5為陽性,以出現陽性反應的最高稀釋度作為抗體的效價。

1.2.7 質粒轉染 按照Lipofectamine 2000轉染說明書推薦的轉染方法轉染HEK 293細胞,置37℃, 5%CO2孵箱培養48小時后進行細胞裂解。

1.2.8 Western blot SDS-PAGE電泳后將蛋白電轉(4℃,恒流300 mA,2小時)到硝酸纖維素膜(NC)上,然后將NC膜在含50 g/L脫脂奶粉的TBST中室溫封閉2小時后,加抗目的蛋白的抗體(1∶600)室溫作用2小時,TBST洗去未結合一抗,再加HRP-羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)室溫作用1小時,TBST洗去未結合二抗,加底物反應3分鐘后暗室曝光并觀察結果。

1.2.9 免疫熒光染色 將細胞接種于14孔板中,細胞密度為2 000～3 000/孔,37℃孵育過夜。24小時后加40 g/L多聚甲醛4℃作用30分鐘固定細胞,再加入5 ml/L TritonX-100,4℃通透化處理20分鐘。然后加100 ml/L驢血清封閉1小時后,加抗目的蛋白的抗體(1∶50)4℃作用過夜。次日加FITC-驢抗兔IgG二抗(1∶200)4℃作用1小時,再加DAPI 4℃染色5分鐘,最后加封片劑,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 構建原核表達質粒

2.1.1 PCR擴增目的片段 經特異性引物進行PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳可得到609 bp的目的條帶(圖1A)。

2.1.2 驗證原核表達質粒 重組質粒pRSET A2-k-Ago2經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現609 bp的目的條帶,與預期結果一致(圖1B)。將酶切鑒定為陽性的克隆進行測序,測序結果用NCBI的BLAST程序分析,結果表明,獲得的k-Ago2編碼序列與預期的Ago2序列區域一致,且在原核表達載體中的連接方向和閱讀框架正確,說明重組質粒構建成功。

2.2 k-Ago2蛋白的表達和純化

圖1 原核表達質粒pRSET A2-k-Ago2的構建Fig.1 Construction of prokaryotic expressed plasmid pRSET A2-k-Ago2

2.2.1 鑒定誘導表達的k-Ago2蛋白 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3),以IPTG誘導蛋白表達,表達產物經SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色在分子量約34 kD處可見一明顯蛋白誘導條帶,說明k-Ago2蛋白在BL21(DE3)菌株中得以表達,且主要以包涵體的形式存在(圖2)。

2.2.2 融合蛋白的切膠回收純化 鑒于融合蛋白大量表達形成包涵體,故對包涵體裂解液進行切膠回收純化,KCl染色時可見兩條白色條帶,均回收進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色分析(圖3A),并以抗His抗體進行Western blot檢測區分(圖3B)。結果顯示目的蛋白得到了高度純化,純度達100%,經標準蛋白BSA標化后濃度約為0.8 g/L,可以用作免疫原。

2.3 抗體效價的檢測 通過間接ELISA法進行檢測后,抗體效價可達到1∶19 000,而作為陰性對照的免疫前兔血清顯色呈陰性。

圖2 k-Ago2融合蛋白表達的確定Fig.2 Determination of k-Ago2 fusion protein expression

圖3 檢測切膠回收純化后的k-Ago2融合蛋白Fig.3 Detection of k-Ago2 fusion protein after purification by gel regaining

2.4 抗體特異性的分析 (1)用純化的k-Ago2蛋白免疫日本大耳白兔后得到兔抗人k-Ago2抗體,以誘導后大腸桿菌檢測k-Ago2抗體,Western blot分析顯示此抗體可特異性與大腸桿菌經IPTG誘導所產生的k-Ago2蛋白結合,與菌體其他成分無交叉反應(圖4A)。(2)以所制備k-Ago2抗體在HEK293細胞裂解液中進行Western blot檢測,結果可見分子量約97 kD處有一明顯條帶,與文獻報道的Ago2蛋白大小相符,為特異的內源性Ago2蛋白條帶,無明顯非特異條帶,表明該抗體對Ago2蛋白有極高的特異性(圖4B)。(3)以pCDNA3 myc/Ago2表達載體及pCDNA3 myc空載體轉染 HEK 293獲取細胞蛋白裂解液,以抗myc抗體及k-Ago2抗體做Western blot,結果抗myc組顯示外源質粒pCDNA3 myc/Ago2得以表達,k-Ago2抗體組均可見97 kD的目的條帶,且轉染pCDNA3 myc/Ago2組蛋白量明顯高于未轉染質粒組及轉染空載體對照組,表明該蛋白片段所得抗體可特異性識別外源性及內源性Ago2蛋白(圖4C)。

2.5 抗體的初步應用

2.5.1 檢測Ago2蛋白在細胞系中的表達差異 收集人類細胞系胚腎細胞HEK293、喉癌Hep2、乳腺癌MCF-7、宮頸癌HeLa、紅白血病細胞K562、正常肝細胞LO2、原發性肝癌QGY-7703、胃癌MGC-803細胞裂解物,采用Western blot均可檢測到大小正確的目的條帶,可以觀察到不同細胞系中Ago2蛋白的表達差異(圖5A)。

圖4 Western blot分析抗體的特異性Fig.4 Analysis of the specificity of the antibody by Western blot

圖5 多克隆抗體對Ago2蛋白的識別Fig.5 Identification of Ago2 protein by polyclonal antibodies

2.5.2 檢測Ago2蛋白的細胞定位 在 HeLa及QGY-7703細胞中,免疫熒光染色顯示Ago2蛋白存在于細胞質中(圖5B)。

3 討論

自1990年基因轉錄后沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)現象的發現拉開了RNAi的帷幕后,對RNAi技術的研究便成為科研的焦點。至今日,RNAi技術因具有高效沉默特定靶基因的特點而成為一門新興的基因阻斷技術,在病毒感染、腫瘤、移植免疫等疾病的治療上展現出了誘人的廣闊前景。但RNAi作用的確切機制卻仍未得以完全的認識。目前已知,在人類RNAi的過程中,RISC的形成及其發揮作用的過程是RNAi的效應步驟而Ago2蛋白是RISC中具有剪切活性的剪切體(Slicer)[11],在RNAi過程中起到了至關重要的作用。

人類Ago2蛋白全長約97 kD,在原核系統進行全長表達較困難,故本實驗采用DNAstar軟件對人類Ago2基因編碼區進行分析,尋找疏水性弱、抗原性強且位于蛋白質表面可能性高的區域,對該區域進行原核表達,純化及制備抗體。此法以融合蛋白作為抗原可使蛋白質的純化變得容易,且制備抗體時有較高的免疫原性,所制備抗體特異性高,可以有效地避免人類AG O蛋白家族之間的抗原交叉性。

一般地,His融合蛋白可經由Ni2+-NTA樹脂進行純化。但實際操作顯示,融合蛋白在經Ni2+-NTA樹脂純化洗脫后仍有少數非特異條帶存在。基于該蛋白大量表達存在于包涵體中,在此選擇了切膠回收純化的方式。該方法經濟、快速、操作簡便、純化后蛋白純度極高,完全符合制備抗血清的要求,其缺陷在于蛋白染色時出現的為白色條帶,無法明確所有目的蛋白所在位置。但以純化抗原免疫家兔后,得到的抗血清效價很高,且Western blot結果說明該抗體可以與原核表達的k-Ago2及真核表達系統中內源性和外源性Ago2蛋白發生特異反應,說明Ago2抗體制備成功。

總之,在本實驗中,對人類Ago2片段進行原核表達,純化,成功制備了特異性極高的人類Ago2抗體,這不僅驗證了蛋白切膠回收純化制備蛋白抗原的可行性,更重要的是,該抗體成功檢測各細胞系中Ago2的表達差異及在細胞中的Ago2定位,這為RNAi機制的進一步深入研究提供了重要工具,為RNAi技術在多種疾病中展開基因治療起到了奠基作用。

1 Hannon GJ.RNA interference[J].Nature,2002;418:244-251.

2 Mello C C,Conte D Jr.Revealing the world of RNA interference[J].Nature,2004;431:338-342.

3 Zaratiegui M,Irvine D V,Martienssen R A.Noncoding RNAs and gene silencing[J].Cell,2007;128(4):763-776.

4 Hammond S M.Dicing and slicing:the core machinery of the RNA interference pathway[J].FEBSLett,2005;579(26):5822-5829.

5 K loosterman W P,Plasterk R H.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease[J].Dev Cell,2006;11(4):441-450.

6 Hutvagner G,Simard MJ.Argonaute proteins:key players in RNA silencing[J].Nat Rev Mol Cell Bio,2008;9(1):22-32.

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[收稿2009-10-12 修回2009-11-24]

(編輯 許四平)

Generation and preliminary application of polyclonal antibodies against human Argonaute2

LI Hai-Fang,PU Yong,TANGShi-Ming,QIANG Ran,TANG Hua.Tianjin Life Science Research Center and Basic Medical School,Tianjin Medical University,Tianjin300070,China

Objective:T o generate rabbit polyclonal antibody against human Argonaute2(Ago2)protein and to identify its functional characterization for determinationof differential expression and cellular localizationof Ago2 protein in various cell lines.Methods:DNAstar software was appliedfor searching the high antigenicity regionof Ago2 gene sequence termed k-Ago2.Prokaryotic expressingplasmid was constructed and transformed toE.coliBL21(DE3)to induce expression by IPTG.The fusion protein was injected into rabbits subcutaneously to produce polyclonal antibodies after purification by gel regaining.ELISA was operated to detect antibody titer.Western blot was used to identify the specificity and sensitivity of the antibodies and detect the differential expression of Ago2 protein in various cell lines.Meanwhile,immunofluorescence experiments were arranged to show cellular localization of Ago2 protein.Results:The prokaryotic expressing plasmid was constructed correctly.K-Ago2 protein was expressed and purified,and then rabbit polyclonal antibodies against Ago2 were generated after immunization with k-Ago2 protein.The titer detected by ELISA was 1∶19 000.Western blot results demonstrated the high specificity of the antibodies.Finally,we successfully observed the differential expression and cellular localization of Ago2 protein in various cell lines.Conclusion:The polyclonal antibody against Ago2 protein has been achieved successfully.It will be propitiousfor the intensive studyof the RNAi mechanism and even profound clinical application.

Argonaute2 protein;Polyclonal antibodies;RNA interference;RNA-induced silencing complex

Q78 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)03-0241-05

①本文為國家自然科學基金項目(No.30873017)、天津市自然科學基金重點項目(No.08JCZDJC23300,No.09JCZDJC17500)

李海芳(1983年-),女,在讀碩士,主要從事病毒學與分子生物學及小RNA與疾病的研究,E-mail:felice-sea@163. com;

及指導教師:湯 華(1963年-),男,博士生導師,主要從事病毒學與分子生物學及小RNA與疾病的研究,E-mail:htang2002@yahoo.com。