下調HMGA2基因表達對改善骨肉瘤U2OS細胞惡性表型的實驗研究①

曲珊珊 李榮貴 張海英 王 洋 史艷芬 呂 慧 李玉林

（吉林大學白求恩醫學院病理生物學教育部重點實驗室,長春 130021）

下調HMGA2基因表達對改善骨肉瘤U2OS細胞惡性表型的實驗研究①

曲珊珊 李榮貴 張海英 王 洋 史艷芬 呂 慧 李玉林

（吉林大學白求恩醫學院病理生物學教育部重點實驗室,長春 130021）

目的:研究HMGA2表達在維持人骨肉瘤U2OS細胞惡性表型中的作用,為基因靶向治療提供理論依據。方法:采用基于DNA的shRNA表達載體HMGA2-shRNA,穩定轉染人骨肉瘤U2OS細胞,下調其HMGA2表達水平,并應用RT-PCR技術檢測其對HMGA2基因的沉默效果;經Cell Counting Kit-8（CCK8）測定、Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察及Boyden小室法分別檢測細胞增殖、凋亡及遷移情況;實時定量RT-PCR檢測m RNAs表達水平。結果:穩定轉染靶向HMGA2的shRNA可特異性下調U2OS細胞HMGA2mRNA表達水平;其作用結果使細胞的增殖和遷移能力受到明顯抑制,自發凋亡率及Caspase 3和Caspas 9基因表達水平顯著升高。結論:HMGA2基因異常表達在維持人骨肉瘤U2OS細胞惡性表型中起重要作用,靶向HMGA2的基因治療可能為骨肉瘤治療帶來新希望。

HMGA2基因;shRNA;骨肉瘤U2OS;細胞增殖;細胞凋亡

骨肉瘤發病率快速增長并趨于年輕化,惡性程度高,預后差,化療或放療效果欠佳,可于數月內出現肺部轉移。因此,尋找骨肉瘤有效的治療方法是骨腫瘤研究的焦點,靶向基因治療被認為是最佳的治療方法之一,尋找有效的治療靶基因極為重要。高遷移率族蛋白A2（Highmobility group A2,HMGA 2）是HMGA家族成員之一,可選擇性結合到DNA特異構像中,調節復制、轉錄及DNA修復。HMGA2是胚胎發育期表達的轉錄因子,在正常成人組織中幾乎無表達。但在一些惡性腫瘤中則呈現高表達,例如乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、視網膜母細胞瘤、鱗狀細胞癌等[1-5],提示其在腫瘤細胞惡性轉化中起重要作用[6]。越來越多的研究顯示,在白血病和一些實體惡性腫瘤細胞群體中只有一少部分細胞具有形成新腫瘤的能力而被稱之為腫瘤起始細胞（Tumor initiating cells,TIC）或癌腫干細胞（Cancer stem cell,CSC）。CSC對化療、放療均不敏感,是惡性腫瘤難以治愈、早期轉移及容易復發的根源[7]。研究表明,HMGA2和H-Ras基因的高表達抑制乳腺癌干細胞分化,而利于其自我更新的維持[8]。miRNAs let-7通過抑制兩者的表達,促使乳腺癌干細胞分化,達到治療乳腺癌的目的[8]。關于HMGA2在人骨肉瘤細胞的表達及作用的研究則尚少見報道。本研究擬通過靶向HMGA2的shRNA真核表達載體穩定轉染人骨肉瘤U2OS細胞,觀察其對U2OS細胞惡性表型的影響,為骨肉瘤的HMGA2靶向基因治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、儀器 U2OS細胞株為吉林大學基礎醫學院病理學系保存。DMEM培養基購自Gibco公司;優級胎牛血清購自北京元亨金馬生物公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑盒、RT-PCR試劑盒購自Takara公司;Cell Counting Kit-8（CCK8）為日本 Dojindo公司產品;Hoechst33342細胞凋亡試劑盒購自鼎國生物科技公司;Boyden小室為美國BD公司產品;鼠尾膠原Ⅰ型購自Sigma公司;2×SYBR GreenⅠ試劑購自ABI公司。Real time-PCR儀為美國ABI7300。

1.2 靶向HMGA2的shRNA真核表達載體HMGA 2-shRNA的構建根據GeneBank中HMGA2人全長cDNA序列（No.003483）,參考文獻[9],選取特異性序列 5′-CGCCAACGTTCGATTTCAT-3′為干擾作用的靶點,加入9 bp的loop環結構,設計模板為Sence+Loop+Antisence,退火后插入pGenesil質粒（含GFP熒光蛋白及G418篩選標志）,形成shRNA表達載體（HMGA2-shRNA）, 其 序 列 為 :5′-CGCCAACGTTCGATTTCATTTCAAGAGATAGAAATCGAACGTTGGCG-3′。另行設計一條與人的任何基因序列均無同源關系的隨機亂碼scrambled DNA序列,其形成的shRNA不對任何人源mRNA進行干擾。上述質粒載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。

1.3 細胞培養及穩定轉染 人骨肉瘤U2OS細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養。轉染前一天接種細胞于24孔板,每孔5×104個細胞。具體操作步驟按Lipofectamine2000脂質體轉染試劑廠家說明書進行,分別將HMGA2-shRNA及scrambled載體轉染U2OS細胞。將轉染細胞按照25個細胞/m l密度接種于6孔板內,每孔 2m l細胞懸液,并以600μg/L的G418進行篩選,2周后胰酶消化法挑取轉染成功的克隆,獲得克隆株。

1.4 RNA提取及RT-PCR 分別按照產品說明書,應用Trizol試劑提取細胞總 RNA;RT-PCR試劑盒（Two-Step Reverse Transcription-PCR法）分析HMGA2 mRNA。反應程序為:94℃預變性2分鐘;94℃變性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸30秒,循環30次;最后72℃延伸5分鐘。RT-PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后紫外燈下觀察并用凝膠成像系統進行掃描和圖像分析。凋亡相關基因表達分析采用實時定量RT-PCR（SYBRGreen法）進行。反應程序為:50℃2分鐘;95℃10分鐘;92℃10秒,60℃30秒,共50個循環。上述引物由上海生工生物工程公司合成,見表1。

1.5 細胞生長曲線測定 采用CCK8試劑盒檢測各組細胞增殖反應。取指數生長期細胞,以1×103細胞/孔接種于96孔板,100μl/孔,按照實驗分組進行標記,每組 6個復孔,于接種 1天、2天、3天、4天、5天、6天每孔加入CCK8液10μl,置于 37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱繼續培養1小時,室溫下振蕩5min,靜置10分鐘;酶標儀490 nm處測定吸光度,繪制細胞生長曲線。

1.6 細胞凋亡檢測 采用Hoechst33342熒光染色法檢測各組細胞凋亡。呈指數生長期的細胞經胰酶消化后,收集每組細胞（1 000 r/min,離心5分鐘）,PBS洗2次,調整細胞密度為1×105細胞/m l,Hoechst33342（10mg/L）避光染色10分鐘,取10μl細胞懸液涂片室溫干燥后,4%多聚甲醛固定10分鐘,然后PBS洗2次,室溫干燥,熒光顯微鏡350 nm波長下觀察并拍照。

1.7 細胞遷移測定 采用Boyden小室（孔徑為8 μm）測定各組細胞遷移。用0.1%鼠尾膠原Ⅰ型溶液包被Boyden小室,37℃結合1小時之后棄去溶液4℃保存。無血清培養基水化Boyden小室10分鐘,再以含1%血清的培養基水化90分鐘。常規胰酶消化各組細胞,PBS洗2次,無血清培養基調整細胞密度為5×104細胞/ml,6孔板內加入3T3細胞條件培養基1.6ml/孔,將 Boyden小室置于其內,上室加入800μl細胞懸液,于37℃,5%CO2條件下培養2.5小時,棄去上室培養基,4%多聚甲醛溶液固定20分鐘,HE染色,用生理鹽水棉簽輕輕拭去小室上層的細胞,倒置顯微鏡下觀察,200×視野下選取5個不重復視野照相,并數遷移細胞數量。

表1 PCR擴增所用引物及序列Tab.1 Primer sequence used for the PCR amp lification

1.8 統計學處理 所有數據采用SPSS10.0軟件進行統計學分析,所得結果用±s表示,采用方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染HMGA2-shRNA可下調U2OS細胞HMGA2 mRNA表達 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,各實驗組細胞樣本均可在250 bp處見亮度一致的β-actin條帶。在未轉染組和scrambled組可在270 bp處見明顯的HMGA2目的條帶,而轉染HMGA2-shRNA組HMGA2表達明顯受到抑制,經灰度值測定HMGA2 mRNA下調達60%～75%（圖1）。

2.2 轉染HMGA2-shRNA可抑制U2OS細胞增殖細胞生長曲線顯示,未轉染組和scrambled組細胞生長無顯著差異,轉染HMGA 2-shRNA質粒的U2OS細胞生長緩慢,生長受到明顯的抑制,4、5和6天的細胞數均明顯低于scrambled組（P＜0.05）（圖2）。

圖1 HMGA2-shRNA下調U2OS細胞HMGA2 mRNA表達的RT-PCR結果Fig.1 Result of down regulation of HMGA2m RNA exp ression in U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA

2.3 轉染HMGA2-shRNA可促進U2OS細胞凋亡熒光顯微鏡下觀察可見,與未轉染組和scrambled組相比,轉染HMGA2-shRNA組U2OS細胞凋亡細胞數量明顯增加。凋亡細胞表現為細胞核濃縮及細胞核碎裂等典型改變,未轉染組和scrambled組細胞無顯著細胞凋亡形態學改變,代表性的圖片如圖3所示。

2.4 轉染HMGA 2-shRNA可降低U2OS細胞遷移能力 Boyden小室遷移實驗結果顯示,細胞在接種2.5小時后,未轉染組和scrambled組遷移細胞數分別為（118±22.1）個和（96±18.6）個,兩者無顯著差異,而HMGA2-shRNA組細胞移至微孔膜下層的細胞數為（47±11.9）個,與scrambled組相比遷移細胞數明顯減少,差異顯著（P＜0.01,圖4）。

2.5 轉染HMGA2-shRNA對細胞凋亡相關基因表達的影響 與未轉染組和scrambled組比較,轉染HMGA2-shRNA組U2OS細胞的凋亡基因Caspase 3和Caspase 9mRNA表達水平上調（圖5）。

圖2 HMGA2-shRNA抑制U2OS細胞生長Fig.2 Proliferation of U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA was inhibited

圖3 各組U2OS細胞的凋亡熒光顯微鏡觀察圖（Hoechst33342熒光染色,×200）Fig.3 The apop tosis of U2OS cells（Hoechst33342 fluorescent staining,×200）

圖4 HMGA2-shRNA降低U2OS細胞遷移能力（×200）Fig.4 Themigratory ability of U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA was degraded（×200）

圖5 轉染HMGA2-shRNA對U2OS細胞凋亡相關基因表達的影響Fig.5 Effect of HMGA2-shRNA on exp ression of apoptosis related gene in U2OS cells transfected with HMGA2-shRNA

3 討論

本研究結果顯示,穩定轉染靶向HMGA2的shRNA表達載體有效地下調了U2OS細胞中HMGA 2 mRNA水平,但不影響β-actin的表達水平,表明其沉默基因表達的特異性。表達質粒介導的shRNA在人骨肉瘤細胞的持續表達及對靶向基因的特異負向調控,提示這一技術在骨肉瘤治療中具有可行性。本研究特異下調HMGA2表達引起U2OS細胞增殖和遷移能力的明顯抑制,顯示HMGA 2的異常高表達對該細胞增殖和遷移能力的維持具有十分重要作用。細胞增殖能力是決定惡性腫瘤生長速度的關鍵因素,而腫瘤的侵襲和轉移力則決定于腫瘤細胞遷移能力。上述結果提示,HMGA2的表達失調可能是導致骨肉瘤惡性程度高、侵襲能力強、病程進展快和容易早期轉移的主要原因。本研究結果中,下調HMGA 2表達也引起U2OS細胞凋亡的明顯增加,表明其異常表達可能也參與了U2OS細胞逃逸免疫監視功能有關。細胞凋亡是機體清除突變細胞維持自身穩定的重要機制,腫瘤細胞通過避免細胞凋亡及免疫機制的監控才得以生存。化療藥物也多是通過誘導細胞凋亡以來達到治療目的。獲得對藥物誘導凋亡的抗性是多數惡性腫瘤對化療藥物治療不敏感的根本原因?？傊?本研究結果表明HMGA2的異常高表達在維持U2OS細胞惡性表型的多方面發揮作用,提示靶向HMGA2的基因療法在臨床骨肉瘤的治療中具有很好的應用前景。

1 Rogalla P,Drechsler K,Kazmierczak Betal.Expression of HMGI-C,a member of thehighmobility group protein family,ina subsetof breastcancers:relationship to histologic grade[J].Mol Carcinog,1997;19（3）:153-156.

2 Meyer B,Loeschke S,Schultze Aetal.HMGA 2 over expression in nonsmall cell lung cancer[J].MolCarcinog,2007;46（7）:503-511.

3 Abe N,Watanabe T,Suzuki Yetal.An increased highmobility group A2 expression level is associated withmalignant phenotype in pancreatic exocrine tissue[J].Br JCancer,2003;89（11）:2104-2109.

4 Chau K Y,Manfioletti G,Cheung-Chau KWetal.Derepression of HMGA 2 gene expression in retinoblastoma is associated with cell proliferation[J].M olMed,2003;9:154-165.

5 M iyazawa J,Mitoro A,Kawashiri Setal.Expression ofmesenchyme-specific gene HMGA 2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity[J].Cancer Res,2004;64（6）:2024-2029.

6 Wisniewski JR,Schwanbeck R.High mobility group I/Y:multifunctional chromosomal proteins causally involved in tumor progression andmalignant transformation（review）[J].Int JMolMed,2000;6（4）:409-419.

7 Reya T,Morrison S J,Clarke M Fetal.Stem cells,cancer,and cancer stem cells[J].Nature,2001;414（6859）:105-111.

8 Yu F,Yao H,Zhu Petal.let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells[J].Cell,2007;131（6）:1109-1123.

9 Malek A,Bakhidze E,Noske Aetal.HMGA 2 gene is a promising target for ovarian cancer silencing therapy[J].Int JCancer,2008;123（2）:348-356.

[收稿2009-12-19]

（編輯 許四平）

Down regulation of HMGA2 expression changesmalignant phenotypes themalignant phenotype of human osteosarcoma U2OS cells

QUShan-Shan,LIRong-Gui,ZHANGHai-Ying,WANGYang,SHIYan-Fen,LüHui,LIYu-Lin.KeyLaboratoryof Pathobiology,MinistryofEducation,SchoolofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:The roles of HMGA2 inmaintainingmalignantphenotypes of theosteosarcoma U2OS cellswas studied to explore the possibilities for it to be developed as a target for gene therapy.Methods:U2OS cellswere stab ly transfectedwith a DNA based shRNA expression vectorwhich targeted to HMGA2.The exp ression of HMGA2mRNA was proved by RT-PCR;Cell growth,migration and apoptosiswere determined with CCK8,hoechst33342 staining and Boyden ventricle,respectively.ThemRNA levels of Caspase 3 and Caspase 9 were determined by real time quantitative RT-PCR.Results:The transfectionwith shRNA exp ression vector significantly decreased HMGA2m RNA levels of U2OS cells.Cellgrow th andm igration were decreased,but apoptosis and themRNA levels of Caspase 3 and Caspas 9were increased following the decrease of HMGA2m RNA.Conclusion:The abnormal expression of HMGA2 plays an important role inmaintaining themalignant phenotypes of U2OS cells.Gene therapy targeted to HMGA2 could be helpfu l in the treatmentof human osteosarcoma.

HMGA 2;shRNA;U20S;Proliferation;Apoptosics

R730

A

1000-484X（2010）03-0228-04

①本文為國家自然科學基金（30872193）

曲珊珊（1980年-）,女,在讀博士,主要從事腫瘤生物學研究;

及指導教師:李榮貴（1952年-）,男,教授,博士生導師,主要從事腫瘤分子病理學研究。