熱處理淋巴瘤細胞增強樹突狀細胞介導的抗瘤效應研究

艾麗梅 潘 靜 孫園園 （遼寧醫學院附屬第一醫院血液科,錦州 121001）

熱處理淋巴瘤細胞增強樹突狀細胞介導的抗瘤效應研究

艾麗梅 潘 靜 孫園園 （遼寧醫學院附屬第一醫院血液科,錦州 121001）

目的:探討淋巴瘤細胞熱處理后作為抗原,沖擊樹突狀細胞而引發的抗淋巴瘤免疫效應。方法:用健康人外周血分離出單核細胞,體外培養樹突狀細胞（Dendritic cells,DCs）,將淋巴瘤細胞株熱處理（42℃,2小時）培養24小時后負載于DCs,在流式細胞儀上檢測DCs的免疫表型變化;負載抗原后的DCs與淋巴細胞混合反應,以MTT法評價細胞毒性及在流式細胞儀上檢測淋巴細胞的免疫表型;ELISPOT法檢測細胞內因子IFN-γ的釋放。結果:在兩實驗組中,DCs負載了熱處理的淋巴瘤抗原后,細胞表面的共刺激分子和MHCⅡ類分子表達水平較對照組明顯增加（P＜0.05）,而兩組之間差別無顯著性（P＞0.05）;經熱處理的腫瘤細胞負載于DCs后,與淋巴細胞混合后IFN-γ的釋放量明顯增加;混合淋巴細胞反應后,細胞毒性實驗（MTT法）和流式細胞儀檢測結果均顯示兩實驗組的殺瘤作用強于對照組（P＜0.05）,兩組之間無顯著差別（P＞0.05）。結論:用熱處理的淋巴瘤細胞作為腫瘤抗原沖擊DC,能夠增強抗淋巴瘤效應。

熱處理;淋巴瘤;樹突狀細胞

淋巴瘤（Lymphoma）是一類異常復雜的疾病,近十年來患病率逐年增加,因此人們對其研究也不斷深入,從而推動了治療方法上的改進。免疫學技術和分子生物學技術的飛速發展促進了腫瘤免疫治療的研究,特別是淋巴瘤的治療,更是突破了傳統的放療、化療手段,結合生物治療突顯其優勢,而生物治療包括了大部分的免疫治療,可見,淋巴瘤的免疫治療具有重要性和遠大的應用前景[1-3]。

抗腫瘤免疫應答產生的重要條件是具備有效加工和通過合適MHC分子提呈的腫瘤特異抗原。樹突狀細胞（DC）是引起有效的T細胞免疫的最強的抗原提呈細胞。隨著近年對大量擴增人DC技術的成熟,使利用這些抗原負載后的DC作為治療性疫苗成為可能[4,5]。目前由于腫瘤抗原的限制性,多用整個細胞抗原負載DC使其經過“自然”加工和選擇抗原表位,引發包含CD4+T細胞和細胞毒性淋巴細胞（CTL）克隆產生的免疫反應。熱處理腫瘤細胞可誘導熱休克蛋白（HSP）表達增加,而近年來人們發現HSP具有參與抗原呈遞、誘導 DC成熟等作用[6],本實驗基于上述觀點而將淋巴瘤細胞熱處理后負載于DC,對其抗腫瘤的免疫效應進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 IMDM培養基（Iscove's Modified Dulbecco'smedium,IMDM）和胎牛血清均為美國Gibco公司產品;人淋巴細胞分離液為天津灝洋生物公司產品;細胞因子GM-CSF、rIL-4為廈門特寶生物藥業有限公司產品;CD4、CD8、CD25、CD56、CD83、CD80、CD86 、HLA-DR等單克隆抗體和流式細胞儀（FACSCalibur）均為美國Becton Dickinson公司產品;MTT（噻唑鹽）購自Sigma公司;ELISPOT試劑盒為瑞典Mabtech公司產品;人淋巴瘤細胞株（Daudi和Namalva）為北大醫院血液科細胞治療室饋贈。

1.2 體外培養樹突狀細胞 取健康志愿者外周血分離單核細胞。將50ml新鮮外周血緩慢加到淋巴細胞分離液（Ficoll液）表面,與其比例為1∶3,離心（2 000 r/min,20分鐘）,吸取中間白膜層到另一離心管中,用PBS液洗一遍（1 250 r/min,10分鐘）后,用IMDM培養液重懸細胞,按每瓶細胞數為1×107個接種到25 cm2培養瓶中。于37℃、5%CO2孵育箱中放置2小時,使細胞貼壁。將懸浮細胞用尼龍毛柱法[7,8]分離出T淋巴細胞,放置液氮中凍存,留作效應細胞。已接種了細胞的培養瓶中加入細胞因子GM-CSF（終濃度1 000U/m l）、IL-4（終濃度500U/m l）。每3天更換一次相同的培養體系。

1.3 熱處理腫瘤細胞 分別取生長狀態良好的Daudi和Namalva細胞株（1×106個）進行熱處理,即在恒溫42℃下培養2小時后,離心（800 r/min,5分鐘）、用PBS重懸細胞、再離心（800 r/min,5分鐘）、加入IMDM 培養液重懸細胞,在37℃、5%CO2孵育箱中繼續培養。

1.4 抗原負載 將熱處理的腫瘤細胞培養24小時后取出,按照不同的實驗組與DC混合,即:熱處理的Daudi細胞負載DC組（H1）,熱處理的Namalva細胞負載DC組（H2）,無熱處理的Daudi細胞負載DC組（Control 1）,無熱處理的Namalva細胞負載DC組（Control 2）。腫瘤細胞與DC混合比例為1∶10。

1.5 流式細胞儀檢測 抗原負載DC 48小時后,在流式細胞儀上檢測DC分化抗原CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表達;負載抗原后的DC與淋巴細胞混合培養4天后,收集懸浮細胞液,檢測各組CD4、CD8、CD25、CD56的表達水平。

1.6 ELISPOT檢測胞內IFN-γ釋放 先將淋巴細胞懸液加到ELISPOT 96孔板中（細胞數2.5×105個/well）,再按不同效靶比例加入各組經抗原刺激的DC細胞,在37℃、5%CO2孵育箱中培養24小時后,按照試劑盒操作步驟說明,進行洗板、加入生物素標記

抗體、再洗板、加酶標親和素、顯色,最后在讀板機上掃描和計數IFN-γ產生細胞。

1.7 細胞毒性實驗（MTT法） DC細胞與淋巴細胞混合反應4天后收集細胞懸液,按不同濃度等級（每濃度復3孔）加到96孔板中（按效靶比為10∶1、20∶1、50∶1）,靶細胞為Daudi和Namalva細胞。在37℃、5%CO2箱中孵育 48小時,每孔加MTT液10μl（5 g/L）,繼續孵育4小時。離心棄上清,每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μl終止反應,震蕩溶解顆粒,用酶標檢測儀于波長570 nm處測定吸光度（A值）,并計算殺傷率。計算公式為:殺傷率=[1-（效靶實驗組A值-效細胞對照A）/靶細胞對照組A值]×100%。

1.8 統計學分析 應用SPSS11.5統計軟件分析實驗結果,數據以均數±s表示,組間比較采用方差分析,P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 樹突狀細胞的免疫表型 如圖1所示,H1組和H2組的CD80、CD86、HLA-DR均較對照組明顯增加,而兩組之間無明顯差別。結果表明,熱處理24小時的Daudi和Namalva細胞沖擊DC后,均使其表面共刺激因子和MHCⅡ類分子表達增加,加速抗原呈遞和促DC的成熟。

2.2 檢測細胞內IFN-γ的釋放 腫瘤細胞經或未經熱處理后負載到DC上,再與自身淋巴細胞進行共培養后檢測IFN-γ的釋放。結果表明（圖2）,IFN-γ產生細胞的數量隨著效靶比例增大而增加,并且實驗組均大于對照組（P＜0.05）。尤以效靶比是1∶10時,與對照組之間比較差別顯著（P＜0.05）。

2.3 淋巴細胞的免疫表型 表1結果顯示,H 1組和H2組的CD8+、CD25+和CD56+細胞數較對照組明顯增加（P＜0.05）,而兩組之間無明顯差別;結果也表明,實驗組中細胞毒性淋巴細胞（CTLs）的生成增加。

2.4 細胞毒性實驗分析 如圖3所示,各組的殺傷活性均隨效靶比（E∶T）增大而增加;H1和H2組的殺傷毒性明顯高于對照組（P＜0.05）,而兩組之間無明顯差別。

表1 淋巴細胞免疫表型分析（%,n=3,±s）Tab.1 Lym phocy tic immunophenotyping（%,n=3,±s）

表1 淋巴細胞免疫表型分析（%,n=3,±s）Tab.1 Lym phocy tic immunophenotyping（%,n=3,±s）

Note:1）Compared with Control 1 and Control 2 group respectively,P＜0.05.

CD4+ CD8+ CD25+ CD56+H 1 33.65±1.04 41.46±1.081） 5.24±0.091） 7.78±0.291）H 2 35.99±0.42 41.52±0.721） 5.13±0.101） 7.71±0.351）Control l 163.88±0.51 22.56±0.65 1.55±0.04 1.24±0.07 Control2 265.84±0.57 23.26±0.88 1.35±0.06 1.29±0.05

圖1 樹突狀細胞（DC）免疫表型Fig.1 Immunophenotype for dend ritic cells

圖2 ELISPOT法檢測細胞因子IFN-γ的釋放Fig.2 Detection of IFN-γsecretion by ELISPOT

圖3 細胞毒性分析Fig.3 Cytotoxicity analysis

3 討論

本研究將熱處理的淋巴瘤細胞作為腫瘤抗原沖擊樹突狀細胞（DC）,通過細胞免疫引發了抗淋巴瘤效應;同時比較對照組的結果,說明確實發生了增強的抗瘤作用。

DC隨著捕獲抗原而成熟,同時抗原被加工成小肽（抗原肽）遞呈給初始T細胞和引發細胞免疫,包括CD4+T（Th1）和細胞毒性CD8+T細胞。因此,明確促發理想DC成熟的刺激很重要,它會誘導腫瘤特異性CTL生成。近年來的研究表明,熱休克蛋白（HSP）具有重要的免疫學意義,包括可以結合于腫瘤抗原肽,協助其提呈。而熱處理可誘發HSP高表達[9,10]。

熱休克蛋白是一種執行管家功能和細胞保護功能的細胞內蛋白,近20年來,越來越多的證據顯示,它還具有重要的免疫學意義。其中,熱休克蛋白的抗腫瘤效應頗值得關注。人們陸續發現多種熱休克蛋白可以參與這種抗腫瘤免疫[11]。HSP對免疫系統的作用不僅是一種分子伴侶,還是一種強有力的佐劑。如Blachere等[12]的實驗表明,熱處理后形成的抗原肽可以被MHCⅠ類分子提呈,激活針對該腫瘤的CD8+T細胞。本實驗結果也表明,經熱處理后腫瘤細胞抗原能增強樹突狀細胞的抗原表達,可以提高抗原提呈能力,最終使抗瘤效應增強,如我們觀察到細胞毒性淋巴細胞在熱處理組產生增多,即標志CTL的CD8+、CD25+和 CD56+細胞率明顯增加,由此推斷,熱休克蛋白在樹突狀細胞介導的抗腫瘤免疫效應機制中能發揮重要作用。我們通過試驗組和對照組的比較發現,由于腫瘤細胞經過熱處理,可能會裂解形成較多的抗原片段來刺激樹突狀細胞,產生的CTL細胞明顯增加,而未經熱處理的腫瘤抗原的作用則不充分。

熱處理后的腫瘤細胞作為抗原沖擊樹突狀細胞,促進其抗原提呈能力并增強抗瘤效應,其中涉及的機制不僅是細胞毒性淋巴細胞數量增加,同時也伴隨細胞因子（干擾素-γ）的釋放量增加,協同阻礙腫瘤細胞的增殖,增強了抗瘤效應。綜上所述,我們由本研究可以得出結論,體外熱處理淋巴瘤細胞株作為腫瘤抗原能增強樹突狀細胞抗淋巴瘤的免疫效應。

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[收稿2009-07-05 修回2009-12-21]

（編輯 倪 鵬）

Enhancement of antitumor immunity of dendritic cells pulsed w ith hypertherm ia lymphoma cells

AILi-Mei,PANJing,SUNYuan-Yuan.DepartmentofHematology,LiaoningMedicalUniversityFirstHospital,Jinzhou121001,China

Objective:To investigate the immuno-effects triggered by dendritic cells（DCs）pulsed with Heat-treated lymphoma cells.Methods:Mononuclear cells from healthy human peripheralblood（PBMC）were isolated and DCswere generated in vitrowith normalmethods.Lymphoma cellswere heated（42℃,2 h）and then loaded onto DCs.Immunotypes of DCs and lymphocyteswere detected with flow-cytometric analysis.IFN-γreleasing was detected by ELISPOT,lymphocyte cytotoxicity was analyzed by MTTmethod aftermixing with DC reaction.Results:After pulsing DCswith hyperthermia lymphoma cells,CD80+,CD86+and HLA-DR existed higher than those of the control group,IFN-γ releasing and cytotoxicitieswere also strengthened,but there was no difference between them,cytotoxitic lymphocytes（CTLs）were produced more as CD8+,CD25+and CD56+cells by flow-cytometric analysis.Conclusion:Anti-lymphoma immuno-effects could be strengthened by loading DCwith hypertherm ia lymphoma cells.

Hyperthermia;Lymphoma;Dendritic cell

R730.51

A

1000-484X（2010）03-0232-04

艾麗梅（1968年-）,女,醫學博士,副教授,主任醫師,主要從事血液腫瘤免疫治療方面的研究。

·神經內分泌與免疫·