實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)病高峰期外周及中樞淋巴細(xì)胞亞群的變化①

席娜娜 鄭榮遠(yuǎn) 尚曉峰 王 潭 呂 錦 徐 德 吳正剛 陳國錢

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,溫州 325000）

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)病高峰期外周及中樞淋巴細(xì)胞亞群的變化①

席娜娜 鄭榮遠(yuǎn) 尚曉峰 王 潭 呂 錦 徐 德 吳正剛 陳國錢

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,溫州 325000）

目的:觀察髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白MOG35-55誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)病高峰期中樞及外周淋巴細(xì)胞亞群的變化,探討EAE發(fā)病高峰期細(xì)胞與體液免疫學(xué)的變化。方法:用MOG35-55免疫誘導(dǎo)雌性C57BL/6小鼠制作EAE模型,記錄小鼠行為學(xué)變化,HE染色觀察CNS炎癥組織病理變化,使用流式細(xì)胞儀檢測小鼠中樞及外周脾臟淋巴細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+細(xì)胞亞群變化情況。結(jié)果:EAE組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+淋巴細(xì)胞的浸潤,CFA陰性對照組中樞神經(jīng)系統(tǒng)未檢測到淋巴細(xì)胞浸潤。EAE組小鼠外周脾細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞較CFA陰性對照組減少（P＜0.05）,B220+細(xì)胞較CFA陰性對照組明顯升高（P＜0.01）,CD4+CD25+細(xì)胞較CFA陰性對照組升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:小鼠在EAE發(fā)病高峰期,外周脾細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+陽性細(xì)胞明顯減少,B220+明顯升高,CD4+CD25+也開始有升高趨勢,表明EAE發(fā)病高峰期細(xì)胞免疫及體液免疫共同調(diào)控了EAE的病理過程,T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞都起了很重要的主導(dǎo)作用。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎;淋巴細(xì)胞亞群;多發(fā)性硬化;T淋巴細(xì)胞;B淋巴細(xì)胞

多發(fā)性硬化（Multipule sclerosis,MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Centralnervous system,CNS）白質(zhì)炎性脫髓鞘為主要病理特點(diǎn)的自身免疫性疾病,其確切病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前認(rèn)為MS是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,激活的T細(xì)胞通過血腦屏障（Blood brain barrier,BBB）與中樞的抗原遞呈細(xì)胞（Antigen presenting cell,APC）,即小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞呈遞的靶抗原結(jié)合,繼而產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子的分泌,進(jìn)一步促使巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞的活化,導(dǎo)致神經(jīng)組織的炎癥脫髓鞘反應(yīng)及神經(jīng)軸索的損害。隨著對MS研究的不斷深入,B細(xì)胞在MS發(fā)病中的作用越來越受到人們重視。腦脊液中持續(xù)的鞘內(nèi)免疫球蛋白（IgG）的合成和寡克隆區(qū)帶的產(chǎn)生已成為一項(xiàng)診斷MS的重要免疫學(xué)指標(biāo)。然而在MS中體液免疫及細(xì)胞免疫病理機(jī)制仍未完全闡明。

成熟T細(xì)胞可分為CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞,CD4+T細(xì)胞主要參與輔助作用（TH）及遲發(fā)超敏反應(yīng)（TDTH）,CD8+T細(xì)胞主要參與細(xì)胞毒作用（TC）及免疫抑制（TS）作用。CD4+與CD8+細(xì)胞的數(shù)量及比值的變化將影響到機(jī)體的免疫平衡。而CD4+CD25+細(xì)胞,即調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞可以抑制CD4+與CD8+細(xì)胞的增殖,在機(jī)體免疫平衡中也發(fā)揮著重要作用。

由于MS患者標(biāo)本只能檢測到患者外周血及腦脊液中淋巴細(xì)胞變化,限制了對MS中樞細(xì)胞病理機(jī)制的深入研究。目前MOG35-55誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimentalautoimmune encephalom yelitis,EAE）可模擬MS神經(jīng)功能及病理學(xué)上的改變,是一種公認(rèn)的MS動物模型[1]。我實(shí)驗(yàn)室已用MOG35-55成功誘導(dǎo)出穩(wěn)定的小鼠EAE模型[2]。本實(shí)驗(yàn)通過對EAE組小鼠大腦、脊髓及外周脾細(xì)胞中淋巴細(xì)胞的分離及檢測,試圖分析在EAE發(fā)病過程中外周及中樞部分T、B淋巴細(xì)胞亞群的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器 SPF級野生型C57BL/6小鼠（由美國波士頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供）,雌性,6～8周齡,體重18～20克,12只。MOG35-55,純度＞95%（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）,購于西安聯(lián)美生物科技有限公司;人結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,H37RA）購于美國Difco公司;不完全弗氏佐劑（Freund′s ad juvant incomplete,IFA）、百日咳毒素（Pertussis toxin,PT）、淋巴細(xì)胞分離液（Percoll液）購于Sigma公司;淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體CD3（APCHamsteranti-mouse）、CD4（FITCanti-mouse）、CD8（PE anti-mouse）、CD25（APC anti-mouse）、CD25 對照（APC Rat IgG1 Isotype Control）、B220（PE-Cy5.5 anti-mouse/humanCD45R）購于美國eBioscience公司;流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）為BD公司產(chǎn)品;水平離心機(jī)為Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 EAE模型制作 小鼠分組:野生型EAE組6只;野生型CFA陰性對照組6只。

抗原配制及EAE模型制作:①抗原配制:將MOG35-55用 0.01 mol/L的 PBS稀釋成 1 mg/0.45ml的溶液;將8 mg的H 37RA用1ml的IFA稀釋成8 mg/m l的CFA溶液;將MOG稀釋溶液與CFA溶液等體積接三通管冰浴快速混勻10分鐘,至油包水狀態(tài),即為抗原乳劑。②EAE模型制作:EAE組,小鼠背部分4點(diǎn)皮下注射抗原乳劑0.2m l/只;CFA陰性對照組,用0.01mol/L的PBS代替MOG35-55稀釋溶液與CFA溶液等體積混合制備抗原乳劑,過程同EAE組抗原乳劑制備。免疫后0、48小時(shí)給予腹腔注射500 ng/0.95m l PBS的PT溶液0.2m l。自免疫當(dāng)日起每天早晚稱量小鼠體重,觀察小鼠行為及神經(jīng)功能表現(xiàn),發(fā)病開始記錄神經(jīng)功能評分以便了解病情進(jìn)展。

1.3 神經(jīng)功能評分及標(biāo)準(zhǔn) 使用較為敏感的Weaver 15分法[3]累計(jì)積分,其標(biāo)準(zhǔn)為:尾巴:無異常0分、尾半癱 1分、尾全癱 2分;四肢:無異常 0分、步態(tài)改變1分、輕癱2分、全癱3分（四個(gè)肢體分別評分后累加）;死亡15分。

1.4 組織病理學(xué)評分 小鼠發(fā)病高峰期麻醉后心臟灌注處死,取腰髓做石蠟包埋,每隔25μm間斷連續(xù)切片,片厚5μm,然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察病理變化,評分標(biāo)準(zhǔn)[4]（Okuda 1998）如下:400倍鏡下計(jì)數(shù):沒有炎癥變化為0;炎癥細(xì)胞浸潤僅限于血管周圍為1;脊髓內(nèi)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤為2（1～10/視野）;脊髓內(nèi)中度的炎癥細(xì)胞浸潤為 3（11～100/視野）;脊髓內(nèi)重度炎癥細(xì)胞浸潤為4（＞100/視野）。

1.5 外周及中樞淋巴細(xì)胞分離及檢測 小鼠發(fā)病高峰期麻醉后心臟灌注處死,無菌條件下取一半大腦、腦干、頸胸髓、脾臟置于裝有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中,傳至超凈臺處理。

將頸胸髓及大腦、腦干的脊膜、腦膜去除干凈,組織分離成小塊,小心研磨使腦組織中的淋巴細(xì)胞充分游離,用200目尼龍網(wǎng)過濾,離心后用 40%的Percoll液重懸,小心將混合液移至70%Percoll液液面上方,注意保持分界面不被破壞,然后使用水平離心機(jī)JS 5.3、600 r/m in、25℃、20分鐘分離淋巴細(xì)胞。離心后MOG組標(biāo)本出現(xiàn)一白色霧狀層,即為淋巴細(xì)胞所在層面,將其吸出用含2%BSA的0.01 mol/L的DPBS液清洗。細(xì)胞計(jì)數(shù)后取104細(xì)胞加淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體CD3、CD4、CD8、CD25、B220及陰性對照,暗室孵育30分鐘,1ml PBS充分清洗細(xì)胞,用1%pH7.2的多聚甲醛液150μl將細(xì)胞固定待檢。

將脾臟周圍脂肪及纖維組織去除干凈,用針刺法制備脾細(xì)胞懸液,收集細(xì)胞后用紅細(xì)胞裂解液充分去除紅細(xì)胞,PBS清洗、細(xì)胞計(jì)數(shù)后將106脾細(xì)胞加淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體 CD3、CD4、CD8、CD25、B220及陰性對照,之后操作同中樞標(biāo)本制備。

細(xì)胞標(biāo)本用FACS-Calibur流式細(xì)胞儀對淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記抗體進(jìn)行分選檢測,數(shù)據(jù)采用CellQuest 3.2軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,臨床癥狀評分、潛伏期、達(dá)峰時(shí)間、病理評分、淋巴細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)用±s表示,兩樣本比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EAE發(fā)病情況 EAE組小鼠臨床癥狀最早出現(xiàn)于免疫后第12天,最遲在免疫后16天,潛伏期為（12.83±1.83）天,癥狀在3～6天達(dá)高峰,達(dá)峰時(shí)間為（18.17±1.94）天。EAE組6只小鼠全部發(fā)病,最大癥狀評分為（8.83±3.26）分。發(fā)病期小鼠多數(shù)以尾部遠(yuǎn)端張力下降、行走時(shí)尾尖部拖地為首發(fā)癥狀,少數(shù)以行走時(shí)步態(tài)搖晃為首發(fā),繼而出現(xiàn)全尾癱瘓、后肢無力、后肢癱瘓、前肢無力等癥狀。另外還表現(xiàn)為活動減少、食欲降低、毛色暗淡、體重減輕（見圖1、2）等。

圖1 免疫后CFA組及EAE組小鼠平均體重變化Fig.1 Weight change in CFA and EAE group after immunization

圖2 免疫后CFA組及EAE組小鼠日均評分Fig.2 Mean daily clinical scores in CFA and EAE group after immunization

2.2 病理學(xué)改變 蘇木精-伊紅染色（見圖3、4）,EAE小鼠發(fā)病高峰期都可觀察到腰髓有大量的炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主,多分布于灰質(zhì)與白質(zhì)交界處,發(fā)病較嚴(yán)重的可見脊膜不完整,并有大量淋巴細(xì)胞浸潤。部分小血管周圍被炎癥細(xì)胞浸潤,形成典型的“血管袖套樣”（Cuffing）改變,并且病理評分與神經(jīng)功能評分基本符合。

2.3 淋巴細(xì)胞變化 EAE組高峰期小鼠外周脾細(xì)胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞較CFA陰性對照組減少（P＜0.05）,B220+細(xì)胞較CFA陰性對照組明顯升高（P＜0.01）,CD4+/CD8+、CD4+CD25+細(xì)胞較CFA陰性對照組升高但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EAE組高峰期小鼠中樞神經(jīng)組織（大腦、腦干、頸胸髓）CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+淋巴細(xì)胞浸潤明顯,而CFA陰性對照組小鼠中樞未檢測到淋巴細(xì)胞浸潤（見表1、圖5～8）。

圖3 CFA陰性對照組小鼠腰髓（蘇木精-伊紅染色,×400）Fig.3 Lumbar cord of CFA controlgroup（stained by HE,×400）

圖4 EAE組小鼠腰髓可見灰質(zhì)明顯炎癥細(xì)胞浸潤（蘇木精-伊紅染色,×400）Fig.4 Thereare obvious in flammatory cells infiltrating in grey matter in lumbar cord of EAE group（stained by HE,×400）

表1 EAE組與CFA組不同淋巴細(xì)胞亞群所占比例比較Tab.1 Comparisons of percentages of lymphocyte subsets between EAE and CFA groups

圖5 流式細(xì)胞儀分析CFA陰性對照組外周脾臟淋巴細(xì)胞（CFA）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+所占百分?jǐn)?shù)Fig.5 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+in the periphery lymphocytes of CFA control group（CFA）,analyzed by flow cy tometry

圖6 流式細(xì)胞儀分析EAE組高峰期外周脾臟淋巴細(xì)胞（S）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)Fig.6 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+cell in the periphery lymphocytes of EAE crest-time group（S）,analyzed by flow cytometry

圖7 流式細(xì)胞儀分析EAE組高峰期中樞神經(jīng)組織淋巴細(xì)胞（B）中 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、B220+所占百分?jǐn)?shù)Fig.7 The percents of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+,B220+in the center nervous system lymphocytes of EAE crest-time group（B）,ana lyzed by flow cy tometry

圖8 高峰期EAE組與CFA組不同淋巴細(xì)胞亞群所占比例比較Fig.8 Comparisons of percentages of lymphocyte subsets between EAE crest-time group and CFA group

3 討論

MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠的EAE是MS的一種經(jīng)典模型,本實(shí)驗(yàn)中EAE組小鼠行為學(xué)表現(xiàn)為發(fā)病期體重下降、尾巴癱瘓、步態(tài)異常及不同程度的肢體癱瘓等,其病程在第一個(gè)發(fā)病高峰期以內(nèi)呈現(xiàn)慢性遷延性,病理見腰髓白質(zhì)為主的炎性細(xì)胞浸潤和血管“袖套”樣改變等,與文獻(xiàn)[1,2]報(bào)道相符合,提示本次實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的EAE模型是成功的,神經(jīng)功能損傷表現(xiàn)及病理學(xué)表現(xiàn)都比較典型。

Mix等[5,6]發(fā)現(xiàn)MS患者外周血中CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量下降,CD4+/CD8+上升,在腦脊液中CD4+細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+上升,而CD8+細(xì)胞數(shù)量下降。在本次實(shí)驗(yàn)中,EAE組外周及中樞淋巴細(xì)胞分離采用流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果符合文獻(xiàn)報(bào)道MS患者外周血及腦脊液淋巴細(xì)胞改變,提示在EAE高峰期外周淋巴細(xì)胞通過血腦屏障向中樞浸潤,而且CD4+輔助性T細(xì)胞增多占優(yōu)勢。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群,可以抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn),在MS患者外周血中 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制作用減弱,而其數(shù)量無明顯變化[7,8]。而在多數(shù) EAE研究中也發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制功能缺失時(shí)病情明顯加重,轉(zhuǎn)輸功能正常的異體小鼠Treg對發(fā)病有抑制作用,明顯減輕病理損傷[9,10]。Feger等[11-13]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)-緩解型MS（Relapse-remitting MS,RRMS）患者Treg數(shù)量略有增多,其中記憶性Treg比例增多,而 CD4+CD25+Foxp3+顯著減少,抑制 T細(xì)胞活化功能減弱。本實(shí)驗(yàn)中 EAE組外周、中樞CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞數(shù)稍有增多,但未進(jìn)行進(jìn)一步分型及功能檢測,提示此次檢測到的CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞多數(shù)屬于記憶性Treg細(xì)胞。

目前多數(shù)學(xué)者對B細(xì)胞在MS等自身免疫性疾病中的作用及MS的免疫啟動機(jī)制提出質(zhì)疑[14]。Mathey等[15]在繼發(fā)-進(jìn)展型MS患者的血清中發(fā)現(xiàn)高濃度的針對神經(jīng)束蛋白的抗體,而注射抗神經(jīng)束蛋白抗體至EAE模型鼠可導(dǎo)致疾病的惡化。然而,Bourdette等[16]利用利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)緩解型MS（RRMS）的Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示了該藥對B細(xì)胞消減治療的卓越療效。Matsushita等[17]研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)EAE之前7天使小鼠B細(xì)胞缺失結(jié)果加重小鼠發(fā)病,而誘導(dǎo)EAE 14天后使小鼠B細(xì)胞缺失可減輕小鼠發(fā)病。實(shí)驗(yàn)推測B細(xì)胞不同亞型在EAE不同時(shí)相發(fā)揮不同的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EAE組高峰期小鼠外周B細(xì)胞較CFA陰性對照組明顯升高,而且EAE組高峰期小鼠中樞B細(xì)胞較外周又有升高,提示B細(xì)胞參與了EAE發(fā)病過程。

以往認(rèn)為,Th2細(xì)胞通過分泌IL-4刺激B細(xì)胞增殖和Ig類別轉(zhuǎn)換,上調(diào)B細(xì)胞CD40和MHCⅡ類分子的表達(dá),是輔助B細(xì)胞主要的T細(xì)胞亞群。而最近發(fā)現(xiàn)濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicularhelper cells,Tfh）是主要負(fù)責(zé)輔助B細(xì)胞的T細(xì)胞亞群[18]。本次試驗(yàn)結(jié)果提示B細(xì)胞的異常同T細(xì)胞一起調(diào)控了EAE高峰期的病理變化過程,即在EAE發(fā)病過程中細(xì)胞免疫及體液免疫共同發(fā)揮了重要作用,在炎癥高峰期,隨著康復(fù)期的即將來臨,B細(xì)胞的增殖與功能已開始發(fā)揮主導(dǎo)作用。EAE疾病進(jìn)展中很可能是通過B細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互作用及其不同細(xì)胞亞型的變化來進(jìn)一步調(diào)節(jié)中樞的細(xì)胞與體液免疫反應(yīng),相關(guān)的分子免疫病理有待深入研究。

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[收稿2009-10-20 修回2009-12-14]

（編輯 張曉舟）

The change of periphery and central lymphocyte subsets at the crest-time of experimental autoimmune encephalomyelitism ice

XINa-Na,ZHENGRong-Yuan,SHANGXiao-Feng,WANGTan,LüJin,XUDe,WUZheng-Gang,CHENGuo-Qian.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China

Objective:Toobserve the change of periphery and centra lymphocyte subsets at the crest-time of MOG35-55induced EAE disease inmice,and to exp lore the alteration of cellular immunity and humoral immunity in the invasion process in EAE.Methods:MOG35-55was used to establish EAEmodel in femina C57BL/6 mice.The behavioral changes and the histological scoreswere recorded after them ice were immuned.The changes of CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+and B220+on periphery and centra lymphocytes in spleen,brain and spinal cord were analyzed by flow cytometry.Results:The CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD25+and B220+lymphocyteswere detected in thebrain and spinal cord of EAE groupmice,but theywere notdetected in CFA controlgroup.The CD3+CD4+and CD3+CD8+lymphocytes in the spleen of EAE crest-time group were lower than those in CFA control group（P＜0.05）.The B220+lymphocyteswereobviously higher than in the CFA controlgroup（P＜0.01）.And CD4+CD25+lymphocyteswere slighthigher than the CFA controlgroup.Conclusion:At the crest-time during EAE,the CD3+CD4+,CD3+CD8+lymphocytes of spleen reduced obviously,B220+lymphocytesincreasedmarkedly,and the CD4+CD25+lymphocytes justhave the increasing trend.It indicates that cellular immunity and humoral immunity coregulated the patho-p rocess at the crest-time of EAE,T lymphocytes and B lymphocytes all played important roles in the pathogenesy of EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis;Lymphocyte subset;Multiple sclerosis;T lymphocyte;B lymphocyte

R744.5

A

1000-484X（2010）03-0236-05

①本文為省部共建基金（wkj:2005-2-041）

席娜娜（1982年-）,女,在讀碩士,主要從事脫髓鞘疾病及神經(jīng)免疫學(xué)的研究,E-mail:xinana0844@163.com;

及指導(dǎo)教師:鄭榮遠(yuǎn)（1949年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事脫髓鞘疾病及神經(jīng)免疫學(xué)、神經(jīng)藥理學(xué)的研究,E-mail:zhengry@yahoo.com.cn。