SH-2Kd-HBc四聚體的構建及其初步的檢測應用①

宋 娜 郝友華 楊新星 丁紅暉 楊東亮 （武漢市婦女兒童醫療保健中心檢驗部,武漢 430016）

SH-2Kd-HBc四聚體的構建及其初步的檢測應用①

宋 娜 郝友華②楊新星②丁紅暉②楊東亮②（武漢市婦女兒童醫療保健中心檢驗部,武漢 430016）

目的:sH-2Kd-HBc復合物四聚體的構建與檢測,為進一步檢測抗原特異性T細胞,探討免疫發病機制奠定基礎。方法:將四個生物素化的可溶性復合物單體與熒光標記的親和素結合形成四聚體。采用HBcAg真核表達質粒（pcDNA3-C）通過不同的途徑免疫小鼠,獲得針對核心抗原的特異性CTL,與制備的四聚體共孵育,結合流式細胞儀術進行檢測。結果:三種免疫方法所得到的細胞中,抗原特異性CTL頻數較對照組都有明顯提高（0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05）。顯示制備的四聚體能與抗原特異性T細胞結合,具有檢測功能。三種不同的免疫途徑所引起的抗原特異性的體液免疫應答和細胞免疫應答強度各有不同。與傳統的肌肉注射組相比,基因槍免疫組的體液免疫應答水平較弱而細胞免疫應答水平較強。高壓水注射（HDI）組的體液免疫應答和細胞免疫應答水平都要明顯高于肌肉注射組結論:獲得了功能性的sH-2Kd-HBc復合物四聚體,為進一步檢測抗原特異性T細胞奠定基礎。

sH-2Kd-HBc復合物四聚體;抗原的特異性CTL;基因免疫;基因槍;高壓水注射

對抗原特異性的T細胞的分析一直是細胞免疫研究領域的重點。1992年,Garboczi等[1]首次成功地在體外構建了HLA-A2抗原復合物,在此基礎上建立的MHC-抗原肽四聚體技術結合流式細胞儀快速、多參數檢測和分選等功能,不僅能定量檢測抗原特異性T細胞,還可對CTL的表面標志進行鑒定、分選,成為該領域必不可少的工具[2-5]。目前,基因免疫能誘導強的體液免疫以及細胞免疫應答備受研究者關注[6],而高壓水注射病毒DNA是較為經典的有效造成動物急性病毒感染的方法之一[7]。本研究在已成功地構建及純化生物素化的sH-2Kd-HBc單體的基礎上[8],進一步制備出相應的針對HBV核心蛋白HBc131-139aa的四聚體。同時采用高壓水注射和兩種基因免疫方法在小鼠體內誘導強的特異性T細胞應答,利用制備的四聚體檢測特異性CTL的頻數改變,為深入研究HBV感染過程中特異性CTL應答和效應機制提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料 生物素化的sH-2Kd-HBc單體以及免疫小鼠的pcDNA3-C質粒均由本室構建保存[8];結合熒光染料的親和素（PE-streptavidin）和FITC標記抗CD8抗體分別購自eBioscience公司和CALTAG LAB-ORATORIES;Amicon Ultra-15離心超濾管（YM-100.000-UFC901008）購自M illipore公司;基因槍及制作基因槍子彈的材料由BioRad公司提供;ELISA檢測選用科華“立可讀”HBcAb Kit板;羊抗鼠IgG抗體購自井山公司。

1.2 方法

1.2.1 sH-2Kd-HBc復合物四聚體的形成及純化計算四聚體化所需的鏈親和素（Streptavidin）的量,分次少量地將藻紅蛋白（PE）標記的鏈親和素（PEStreptavidin）加入MHC-peptide單體中,先加入總量的50%,將余量分作10份,每隔20分鐘加入一份,4℃暗室中反應過夜。四聚體化后再裝入100 kD MWCO的超濾管中進行超濾濃縮,可以去除多余的單體,將體積濃縮至＜500μl,最后用 PBS（PH8.0）將總體積定為15ml。如果需長期儲存,可加入蛋白酶抑制劑,NaAzide,Na2EDTA繼續超濾濃縮至一定的體積保證濃度約為0.5～2 mg/m l,再轉入棕色試劑瓶中,4℃避光保存半年至一年。

1.2.2 免疫BALB/c小鼠獲取抗原特異性CTL 免疫方案見表1。

1.2.3 流式細胞儀檢測CD8+、tetramer+CTL細胞收集免疫后小鼠的脾細胞到尖底離心管,600～1 000 r/min離心5分鐘;棄上清,加RBC裂解液2ml靜置6分鐘后再離心;棄上清,用PBS及無血清的1640各洗滌一次;最后加含血清的1640,稀釋10～20倍后,在計數板上計數,將細胞濃度調整至106細胞/m l,加入到6孔板一部分孔內不加刺激物,另一部分孔內加肽及m IL-12等刺激物,放入細胞培養箱。體外刺激5天后收集孔內的細胞,轉移到流式專用試管（2×106細胞/管）,4℃960 r/min離心5～10分鐘,棄上清,加入FACS緩沖液5ml,混勻后再如上條件離心,棄上清,留 50～100μl的FACS緩沖液重懸細胞,于暗處向重懸液加入tetramer（2～3μg）充分混勻置4℃避光染色 2小時,再加入4μl的FITC-CD8抗體充分混勻置4℃避光染色1小時,FACS緩沖液洗滌2次,最后將細胞重懸于400μl FACS緩沖液上機進行流式分析。

1.2.4 ELISA檢測小鼠血清抗HBcAg抗體滴度小鼠血清以 1∶50、1∶100、1∶200 、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200和1∶6 400比例稀釋后加入HBcAb Kit板,37℃孵育1小時,洗孔后各加入100μl稀釋的羊抗鼠IgG抗體,37℃孵育40分鐘,洗板后顯色,測OD值。

2 結果

2.1 利用制備的四聚體檢測抗原特異性CTL 我們所制備的四聚體選擇的抗原肽表位位于HBV核心區,將HBc的真核表達質粒免疫小鼠獲得的特異性T細胞中包括針對選擇的抗原肽表位的CTL,因此能與四聚體結合而被特異性染色,可通過流式細胞儀檢測。結果如圖1,在空質粒對照組中,PE-tetramer和FITC-CD8單抗雙染的陽性細胞頻率為0.07%,而在肌肉注射組、基因槍組和HDI組中,雙染陽性細胞的頻率分別為 0.24%、0.26%和0.36%,利用SAS統計軟件對3組雙染的陽性細胞進行 χ2檢驗分析,A組和B、C、D組之間的P值均小于0.05,具有顯著差異（見表2）。

2.2 ELISA檢測小鼠血清抗HBc抗體滴度 小鼠血清以 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600 、1∶3 200和1∶6 400比例稀釋后作ELISA檢測。當實驗組與陰性對照的OD值之比大于2.1時,視為陽性。結果如圖2顯示,液相高壓注射組和肌肉注射組的抗體滴度至少在1∶3 200以上。其中液相高壓注射組的抗體滴度最高,其次為肌肉注射組,而基因槍免疫組的抗體滴度最低,處于陽性判定的邊緣。

2.3 不同免疫途徑誘導的針對HBcAg的體液免疫應答和細胞免疫應答的比較 小鼠血清以1∶3 200比例稀釋后作ELISA檢測,實驗組與陰性對照的OD值之比為縱坐標（圖2）。將分離的小鼠脾細胞用抗原特異性的tetramer檢測,以各實驗組雙陽性細胞的頻度與對照組的比值為縱坐標（圖3）。結果顯示三種不同的免疫途徑所引起的抗原特異性的體液免疫應答和細胞免疫應答強度各有不同。與傳統的肌肉注射組相比,基因槍免疫組的體液免疫應答水平較弱而細胞免疫應答水平較強。HDI組的體液免疫應答和細胞免疫應答水平都要明顯高于肌肉注射組。

表1 獲取抗原特異性CTL的免疫方案Tab.1 The immunol scheme of aquiring antigenic specific CTL

圖1 Tetramer流式細胞術對特異性CTL的染色與檢測Fig.1 Determ ination of specific CTL by flow cytometry

表2 3組雙染陽性細胞的 χ2檢驗分析Tab.2 Theχ2-test analysis of specific CTL（double staining positive cells）in 3 groups

圖2 針對HBcAg的體液免疫應答Fig.2 Humoral immunoresponse to HBcAg

圖3 針對HBcAg的細胞免疫應答Fig.3 Cellu llar immunoresponse to HBcAg

3 討論

T細胞應答的一個最顯著的特征是針對特異性抗原肽的T細胞頻數的增多,這一反應可通過MHC-抗原肽四聚體與TCR的高親和力,同時結合流式細胞術多參數的分析功能,實現MHC-抗原肽四聚體對特異性CTL的染色與檢測。許多研究從不同角度證實MHCⅠ類分子四聚體對特異性CTL的檢測具有強的抗原特異性與高的敏感性,在免疫學各個領域包括感染免疫、腫瘤免疫及自身免疫疾病中廣泛應用于分析抗原特異性T細胞應答,改變了我們原先對T細胞免疫應答的認識[9-11]。

本研究一方面制備出HBV核心蛋白HBc131-139aa的四聚體,另一方面采用三種免疫的方法在小鼠體內誘導強的特異性T細胞應答,利用制備的四聚體檢測特異性CTL的頻數改變,不僅對四聚體進行了功能鑒定,而且通過我們的四聚體對這三種免疫方法的免疫效果進行了比較。

基因免疫又稱DNA免疫或核酸免疫,是將含有編碼抗原基因的重組真核表達質粒直接免疫機體,使載體上的基因在體內持續表達出天然抗原物質,與自然感染相似,表達的抗原以天然構象提呈給宿主免疫系統,無抗原表位的改變,不僅能誘導體液免疫,更重要的是產生強有力的細胞免疫[12]。肌肉注射DNA疫苗后,注射部位的肌細胞在誘導CTL反應中并不起直接和主導作用。而是肌組織內的抗原提呈細胞（APC）直接吞入質粒,合成抗原蛋白進入MHCⅠ類提呈途徑;或者質粒隨血流進入外周淋巴器官轉染此處的APC;又或者由肌細胞內合成的抗原釋放到細胞外,通過某種方式傳遞給APC再進入提呈途徑[13]。處于再生狀態的較“年輕”的肌細胞攝取重組質粒的能力高于成熟的肌細胞,因此用蛇毒（如心肌毒素）或麻醉劑（如鹽酸布比卡因）對注射部位預處理,使肌細胞受損后再進入再生狀態,從而更有利有于質粒的攝取和表達[14]。

基因槍法,又稱為“高速微彈法”。是將重組質粒包被在金屬微顆粒上（金顆?；蜴u顆粒）,利用高壓加速裝置將顆粒直接轟入受免動物的上皮細胞內,從而提高了質粒DNA轉染效率,是導入基因疫苗的有效方法[15]。皮膚是機體與外界直接接觸的門戶,表皮內含有提呈抗原功能最好的APC即朗漢氏細胞。用于基因槍的金屬顆粒直徑在0.5～0.9 μm之間,遠小于細胞,經加速射出后,有的直接射入到細胞中,包被其上的質粒也一起帶入細胞中;金屬顆粒射入細胞間隙后作為異物可誘導皮下APC發生吞噬作用,增加重組質粒進入細胞比例。經過免疫組化分析表明[16],基因槍射入局部皮膚細胞中的重組質粒有20%可瞬時表達抗原基因,其中1%長期表達。許多研究表明該接種方法主要傾向于誘導Th2型反應,即主要激活CD4+Th2類細胞和分泌IgG1型抗體為主的B細胞[17]。也有研究發現通過基因槍既可誘導保護性的抗體反應又能誘導強的特異性CTL應答[18]。

利用我們制備的四聚體對這三種免疫方法誘導特異性CTL應答和體液應答的效果進行了比較,結果發現三種方法均能誘導出針對HBcAg特異性的CTL應答和體液應答,但是不同的免疫途徑之間存在明顯的差異。肌肉注射質粒DNA作為傳統的基因免疫方法能夠較好的誘導抗原特異性的CTL應答和體液應答。但此方法需要對注射部位進行預處理,而且每次免疫需要100μg的質粒DNA。與之相比,在用基因槍進行免疫時,每次只需要1μg的質粒DNA就足以激發機體免疫應答。與報道不同的是,我們在用HBcAg真核表達質粒通過基因槍免疫小鼠后,機體產生的特異性抗體滴度僅為1∶3 200,明顯低于其他兩組。產生的特異性CTL應答則要高于肌肉注射組。而在HDI組中,不論是特異性CTL應答還是體液應答都要明顯高于前兩組。我們認為這一現象出現的原因可能與質粒所表達抗原的類型和APC的類型有關,即不同的抗原能誘導不同類型的應答,而同一種抗原經不同的APC提呈后也可誘導不同傾向的應答。HDI會導致質粒DNA在肝臟中大量表達,基因槍則將質粒DNA直接送至皮下。在肌肉、肝臟和皮下表達的抗原可能分別由不同類群的APC所提呈,最終影響免疫應答的傾向。這一過程中的抗原提呈機制和免疫調節機制是值得我們重視的研究方向。

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[收稿2009-07-25 修回2009-11-17]

（編輯 張曉舟）

Construction and primary application of sH-2Kd-HBc tetramer

SONGNa,HAOYou-Hua,YANGXin-Xing,DINGHong-Hui,YANGDong-Liang.TheClinicalLaboratoryofMedical&HealthCenterforWomenandChildreninWuhan,Wuhan430030,China

Objective:To prepare and test tetrameric sH-2Kd-HBc complex for the furthermeasurementof the specific CTL response.Methods:PE labled streptavidin with 4 biotinylated binding sites can bind to 4 biotinylatedmonomer to form the corresponding tetramer.Mice were immunized via differentmethods of genetic immunization by use of the construted pcDNA3-C plasmid to get the specific CTLs.Then our prepared tetramerwas applied to stain the specific CTLs by the analysis of flow cytometry.Results:We applied our p repared tetramer to stain the cells from the experimentalgroups and controlgroup.The results showed the tetramerwas able to discriminate the frequencies of specific CTL induced by the three immunolmethods（0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05）.This demonstrated that the prepared tetramer could bind its targets specifically and efficiently.The three immunolmethods induced different levels of immune responses.Compared with the traditionalmuscle injection,gene gun inducedweaker humoral immune response and stronger cellular immune response,and hydrodynamic injection induced the strongest humoral and cellu lar immune responses.Conclusion:Have successfully constructed the sH-2Kd-HBc tetramer.The techniques andmethods can be used for preparation of tetramers of other types ofMHCⅠmolecules.

sH-2Kd-HBc complex tetramer;Antigenic specific CTL;Genetic immunization;Genegun;Hydrodynam ic injection

R392.33

A

1000-484X（2010）03-0245-05

①本文為國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（No.20014CB510008）②華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院臨床免疫室,武漢 430030

宋 娜（1979年-）,女,碩士,醫師,主要從事臨床免疫學研究,E-mail:songna596@126.com;

及指導教師:楊東亮（1955年-）,男,教授,主任醫師,博士生導師,主要從事病毒性傳染病的基礎研究和臨床工作,E-mail:dlyang@tjh.tjmu.edu.cn。