佐劑性關節炎大鼠肺功能變化與Foxp3、TGF-β1/Smads信號傳導通路的相關性研究①

劉 健 萬 磊 盛長健 謝秀麗 （安徽中醫學院第一附屬醫院風濕科,合肥 230031）

佐劑性關節炎大鼠肺功能變化與Foxp3、TGF-β1/Smads信號傳導通路的相關性研究①

劉 健 萬 磊②盛長健②謝秀麗②（安徽中醫學院第一附屬醫院風濕科,合肥 230031）

目的:觀察佐劑性關節炎（Adjuvant arthritis,AA）大鼠肺系數、肺功能變化、調節性 T細胞及 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達,探討Foxp3與TGF-β/Smads信號傳導通路在佐劑性關節炎大鼠肺功能降低中的可能作用機制。方法:將24只Wistar大鼠隨機分為正常對照組和模型組,每組12只,向模型組大鼠右后足跖皮內注射弗氏完全佐劑0.1m l致炎,復制成佐劑性關節炎模型。致炎48天后,觀察兩組大鼠足跖腫脹度及關節炎指數（AI）,計算兩組大鼠肺系數,檢測大鼠肺功能,測定調節性T細胞百分率,HE染色觀察肺病理學改變,免疫組化染色觀察Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達情況。結果:①與正常對照組相比,AA模型組大鼠足跖腫脹度、AI、肺系數、1秒內平均呼氣流量（FEV1/FVC）、肺泡炎積分、TGF-β1及Smad3蛋白表達明顯升高（P＜0.01）;用力肺活量（FVC）、25%肺活量的最大呼氣流量（FEF25）、50%肺活量的最大呼氣流量（FEF50）、75%肺活量的最大呼氣流量（FEF75）、最大呼氣中期流量（MMF）、用力最大呼氣流量（PEF）、肺動態順應性（Cldyn）、CD4+T細胞、CD25+T細胞、CD4+CD25+T細胞百分率、Foxp3蛋白及Smad7蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。②Spearman相關分析可知,AA大鼠肺功能參數中FEF50、MMF與足跖腫脹度呈負相關,MMF與肺系數呈負相關,Cldyn與TGF-β1蛋白積分光密度值呈負相關;FEF50、MMF與關節炎指數呈正相關,FEF75與肺系數呈正相關,FEV1/FVC與Foxp3蛋白表達染色指數、Foxp3蛋白積分光密度值呈正相關（P＜0.05或P＜0.01）。結論:AA大鼠在足跖腫脹度、關節炎指數升高的同時出現肺功能的下降,提示可能是致炎后炎癥的持續、發展而出現慢性炎癥反應導致肺的損傷（肺間質纖維化）,而肺功能的下降與Foxp3、Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表達呈相關性,說明轉錄因子Foxp3和TGF-β1/Smads信號傳導通路共同參與其作用機制。

佐劑性關節炎;肺功能;Foxp3蛋白;TGF-β/Smads信號傳導通路

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種復雜的、多系統的、以關節損害為主要特點的自身免疫性疾病。主要表現為對稱性的多關節腫脹、疼痛、晨僵,體重減輕以及全身多系統的受累。然而病變并非局限于關節,常伴有關節以外的其他臟器病變,甚至可引起主要臟器的血管炎而危及生命。因肺含有豐富的結締組織和血管而更容易受累,且隨著RA病程延長,肺受累的機率增高,導致肺間質纖維化。其發病機制尚不完全清楚,其機制可能與細胞因子網絡失衡有關[1],近年來,關于信號傳導通路在類風濕關節炎中的研究已成為熱點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠24只,鼠齡5～6月,體重量（160±20）克,由南京醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK（蘇）2008-0004。清潔級標準飼養。

1.2 藥品及試劑 弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant）由美國 Sigma公司出品（批號:098k8729）;TGF-β1兔IgG單克隆抗體購自美國Santa cruz公司（批號:sc-146）;Samd3、Samd7單克隆抗體購自美國 LifeSpan公司（批號 LS-C39137、LS-c39135）;Foxp3兔IgG單克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司（批號:bs-0269R）;SP試劑盒和DAB試劑免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司;抗-鼠CD4-FITC購自美國eBioscience公司;抗-鼠CD25-PE購自美國BioLegend公司。

1.3 儀器與設備 動物呼吸機AniRes2003動物肺功能分析系統由北京貝蘭博科技有限公司生產;病理切片機（型號:LEICA KM I135德國石蠟切片機）;光鏡（型號:LEICA DMLB德國顯微鏡）;日本OLYMPUS全自動顯微攝像系統;電子天平（型號:JA5003,上海精密儀器儀表有限公司）。

1.4 動物模型復制與樣品采集 將Wistar大鼠隨機分為2組:正常對照組,模型組,每組12只。向模型組每只動物右后足跖皮內注射Freund's完全佐劑0.1ml致炎,制成佐劑性關節炎（Adjuvant arthritis,AA）模型[2]。致炎48天后用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉,氣管切開后行氣管插管,檢測大鼠肺功能;靜脈采血,6小時內用流式細胞儀檢測調節T細胞;每組常規處死12只動物,打開胸腔取出肺臟,完整分離出氣管和雙肺,去除周圍結締組織,經生理鹽水洗滌后用濾紙吸干,用電子天平稱肺濕重,計算肺系數;取右肺中葉置于10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋、切片、HE染色、免疫組化染色,光鏡檢測。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠足跖腫脹度、關節炎指數的測算 分別在造模前1天、致炎后第18天、給藥后每3天測量各組大鼠后足跖的容積,計算各組大鼠足跖腫脹

度[3]。腫脹度E（%）=（Vt-Vn）/Vn×100%（Vn、Vt分別代

表造模前后的容積）。關節炎指數（Arthritis index,A I）的計算:致炎后第12天開始觀察并記錄全身關節病變程度,每3天1次。全身病變按5級評分法評價,根據未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分,計算出AI[4]。0分:無紅腫;1分:小趾關節紅腫;2分:趾關節和足跖腫脹;3分:踝關節以下的足爪腫脹;4分:包括踝關節在內的全部足爪腫脹。把各個關節的積分累計起來,即為每只大鼠的A I,最高分為12分。

1.5.2 大鼠肺系數的測定 肺系數=肺濕重（mg）/體重（克）×100%。

1.5.3 肺功能測定 致炎后48天,兩組隨機各取10只大鼠,用小動物肺功能儀測定肺功能[5]。測定指標有FVC（用力肺活量）、FEV1/FVC（1秒內平均呼氣流量）、FEF25（25%肺活量的最大呼氣流量）、FEF50（50%肺活量的最大呼氣流量）、FEF75（75%肺活量的最大呼氣流量）、MMF（最大呼氣中期流量）、PEF（用力最大呼氣流量）、Cldyn（肺動態順應性）。操作過程:10%水合氯醛（0.35 ml/100克）腹腔注射麻醉,氣管切開后行氣管插管,將大鼠置于體描箱內,保持頭低位,與呼吸機管路相連,行機械通氣測肺功能。在測定過程中,采用外加壓力的辦法,使動物深吸氣/深呼氣,電腦自動快速而準確地測出各項指標。

1.5.4 病理組織學觀察 將肺組織于4%多聚甲醛中固定8小時后依次予脫水、透明、浸蠟和包埋,并切片（6μm）作HE染色。根據Szapiel[6]等的方法確定肺泡炎的程度:無肺泡炎（-）;輕度肺泡炎（+）:肺泡隔因細胞浸潤增寬,病變范圍局限在全肺的20%以下;中度肺泡炎（++）:病變范圍占全肺的20%～50%;重度肺泡炎（+++）:呈彌漫性分布,病變范圍大于50%;分別記為0、1、2、3分。

1.5.5 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7 蛋白的測定

參照試劑盒鏈霉抗生物素蛋白-過氧化酶（SP）法進行操作。Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7 單克隆抗體1∶100稀釋,每組切片中任選1張用0.01mol/LPBS液代替一抗進行染色,為陰性對照。每張切片任選5個視野,以細胞胞漿、胞質、胞核中出現黃色或棕褐色顆粒為陽性反應。免疫組化染色的半定量判定:①蛋白表達染色指數染色強度A:無色、淡黃、棕黃 、棕褐分別計為 0 、1、2、3 分 ;染 色廣度 B:陽性細胞數占總細胞數的百分比;A、B兩項所得相乘所得數值為免疫組化染色指數,染色指數越高,蛋白表達越強。②積分光密度（IOD）采用圖象分析軟件（美國Image-pro plus專業圖像分析軟件系統,美國Media Cybernetics公司）進行圖像分析,用積分光密度（IOD）表示 Foxp3、TGF-β、Smad3 、Smad7 蛋白的表達 ;計算公式:積分光密度IOD=面積密度×平均光密度。陽性反應IOD越大,表示蛋白表達越強。

1.5.6 流式細胞術對調節T細胞的檢測 取大鼠新鮮血液100μl,按每106個細胞/管分別加入抗-鼠CD4-FITC 0.25μg、抗-鼠 CD25-PE 1.0 μg,避光20～30分鐘;加紅細胞裂解液1ml,避光15～25分鐘;用PBA洗兩遍,離心棄上清,流式細胞儀檢測CD4+CD25+雙陽性細胞（Treg）比例。

1.6 統計學處理 采用SPSS11.5軟件包進行統計學處理,實驗數據為連續性變量用±s表示,計量資料采用t檢驗;等級計數資料轉化為計量資料,計數資料用 χ2檢驗,等級資料用秩和、單因素方差檢驗,相關性分析采用Spearman分析,檢驗水準為0.05或0.01。

2 結果

2.1 兩組大鼠一般情況變化 正常對照組大鼠強壯肥碩,四肢關節無紅、腫及硬化情況,飲食如常,反應靈敏,善打斗,活動正常,體毛順滑有光澤,呼吸平穩,二便正常。AA模型組大鼠四肢關節紅腫、跖趾潰爛,多見體重明顯下降,皮毛干枯、稀疏,蜷縮少動,瞇眼、呆滯、精神萎靡,反應遲鈍,有不同程度的聳毛,飲食、飲水量逐漸減少,大便稀溏;偶有呼吸氣促現象。

2.2 兩組大鼠體重、足跖腫脹度、關節炎指數的比較 致炎前各組大鼠的體重無差異;模型復制后與正常對照組比較,AA模型組大鼠致炎12天體重出現下降,于致炎48天體重下降至最低點;致炎18天足跖腫脹度達最高峰,后逐漸下降;致炎12天模型組大鼠左后足趾、部分雙前足趾開始出現紅腫,致炎32天達高峰,后逐漸下降。見表1。

2.3 兩組大鼠肺系數、肺泡炎積分、肺功能各參數的比較 模型復制第48天對照組肺濕重（mg）范圍為508～712,肺系數范圍2.42～2.78;模型組肺濕重（mg）范圍為568～821,肺系數范圍 3.05～3.98;AA模型組肺系數、肺泡炎積分較對照組明顯增加,差異有統計學意義（P＜0.01）。與正常對照組相比,模型組用力肺活量（FVC）、25%肺活量的最大呼氣流量（FEF25）、50%肺活量的最大呼氣流量（FEF50）、75%肺活量的最大呼氣流量（FEF75）、最大呼氣中期流量（MMF）、用力最大呼氣流量（PEF）、肺動態順應性（Cldyn）較對照組明顯降低;1秒內平均呼氣流量（FEV1/FVC）較對照組明顯升高,差異有顯著性意義（P＜0.01）。見表2。

2.4 兩組大鼠 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7 蛋白表達及調節T細胞百分率的變化（圖1～3） 免疫組化染色顯示:Foxp3主要定位于肺泡上皮細胞、支氣管粘膜上皮細胞胞漿中;TGF-β1主要定位于肺泡上皮細胞、支氣管粘膜上皮細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞等的胞漿中;偶在炎性細胞胞核中表達;Smad3主要定位在炎性細胞的胞漿及胞核中;Smad7蛋白主要定位在肺泡上皮細胞的胞核中,支氣管上皮細胞及少量間質細胞胞漿中也有少量表達,胞質中偶有表達。模型組Foxp3在細胞胞漿中呈弱陽性或陰性表達;TGF-β1在細胞胞漿中呈陽性表達,偶在胞核中陽性表達;Smad3在細胞胞漿、胞核中呈陽性表達;Smad7在細胞胞核中呈弱陽性著色。與對照組比較,AA模型組TGF-β1、Smad3蛋白表達升高,Foxp3、Smad7蛋白表達降低,且差異有顯著性意義（P＜0.01）;AA模型組CD4+T細胞、CD25+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率明顯降低,兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3。

2.5 AA大鼠肺功能與足跖腫脹度、關節炎指數、肺系數、肺泡炎積分 、Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7 蛋白表達及調節T細胞百分率的相關分析 Spearman相關分析結果顯示,AA大鼠肺功能各參數中50%肺活量的最大呼氣流（FEF50）、最大呼氣中期流量（MMF）與足跖腫脹度呈負相關,最大呼氣中期流量（MMF）與肺系數呈負相關,肺動態順應性（Cldyn）與TGF-β1蛋白積分光密度值呈負相關;50%肺活量的最大呼氣流量（FEF50）、最大呼氣中期流量（MMF）與關節炎指數呈正相關,75%肺活量的最大呼氣流量（FEF75）與肺系數呈正相關,1秒內的平均流量（FEV 1/FVC）與Foxp3蛋白表達染色指數、Foxp3蛋白積分光密度值呈正相關,且相關性之間有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。FEV1/FVC與Smad7蛋白表達染色指數呈高度負相關（r=-0.596）,最大呼氣中期流量（MMF）與Foxp3蛋白表達染色指數呈高度負相關（r=-0.582）;用力肺活量（FVC）與Foxp3蛋白表達染色指數、Smad7蛋白積分光密度值呈高度正相關（r=0.690）,用力最大呼氣流量（PEF）與 TGF-β1蛋白表達染色指數、Foxp3、Smad7蛋白積分光密度值呈高度正相關（r分別為0.679,0.596,0.667）,但無統計學意義（P＞0.05）,見表4。

表1 兩組大鼠體重、足跖腫脹度和關節炎指數的比較（±s,n=12）Tab.1 Comparison of weight,paw swelling and arthritis index in 2 groups of rats（±s,n=12）

表1 兩組大鼠體重、足跖腫脹度和關節炎指數的比較（±s,n=12）Tab.1 Comparison of weight,paw swelling and arthritis index in 2 groups of rats（±s,n=12）

Groups Inflammation 0 days weight（g）Inflammation 12 days weight（g）Inflammation 48 days weight（g）Inflammation 18 days AIEGF（%）Inflammation 48 days AIEGF（%）Inflammation 12 days AI Inflammation 48 days AI Normal group 179±13.0 214±13.8 302±8.88 3.60±1.89 7.54±1.70 0.08±0.28 0.17±0.38 Modelgroup 184±15.5 204±12.9 254±11.6 29.2±8.46 17.1±13.0 1.08±0.66 7.08±0.79 P 0.352 0.087 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 兩組大鼠肺系數、肺泡炎積分、肺功能各參數的比較（±s）Tab.2 Comparison of lungs index,alveolar in flammation score,lung function parameters in 2 groups of rats（±s）

表2 兩組大鼠肺系數、肺泡炎積分、肺功能各參數的比較（±s）Tab.2 Comparison of lungs index,alveolar in flammation score,lung function parameters in 2 groups of rats（±s）

Note:1）P＜0.01,compared with the normal controlgroup（The same as below）.

Index n Normalgroup Modelgroup Lung index（100%） 12 2.61±0.08 3.36±0.361）A lveolitis points（分） 12 0.37±0.74 2.75±0.701）Pulmonary function parameters（PFP）FVC（m l） 10 6.09±2.01 5.07±0.271）FEV1/FVC（%） 10 57.7±5.79 68.6±6.381）FEF25（m l/s） 10 45.2±6.21 30.7±2.811）FEF50（m l/s） 10 39.4±6.84 27.0±6.071）FEF75（m l/s） 10 37.7±5.87 20.9±5.311）MMF（ml/s） 10 39.2±5.72 28.5±2.961）PEF（m l/s） 10 39.1±4.87 29.4±2.501）Cldyn（100%） 10 0.36±0.09 0.17±0.081）

表 3 兩組大鼠 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達及調節T細胞百分率變化的比較（±s,n=8）Tab.3 Comparison of Foxp3,TGF-β1,Smad3,Smad7 protein and the percentage of regulation of T-cell in 2 groups of rats（±s,n=8）

表 3 兩組大鼠 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達及調節T細胞百分率變化的比較（±s,n=8）Tab.3 Comparison of Foxp3,TGF-β1,Smad3,Smad7 protein and the percentage of regulation of T-cell in 2 groups of rats（±s,n=8）

Index Normalgroup Modelgroup Protein staining index（PSI）（100%）Foxp3 0.565±0.124 0.176±0.0631）Smad3 0.122±0.046 0.437±0.0791）Smad7 0.681±0.109 0.201±0.0731）TGF-β1 0.125±0.053 0.321±0.0791）IOD（D）Foxp3 0.411±0.102 0.133±0.0391）Smad3 0.129±0.049 0.444±0.0561）Smad7 0.597±0.081 0.167±0.0471）TGF-β1 0.120±0.071 0.486±0.0991）Regulating T-cell percentage（%）CD4+T 40.9±6.51 29.5±3.601）CD25+T 22.4±2.73 15.4±2.421）CD4+CD25+T 9.45±0.81 5.78±0.851）

圖1 AA模型組肺組織免疫組化染色（×400）Fig.1 AA modelgroup immunohistochem icalstaining in lung tissue（×400）

圖2 AA模型組CD4+CD25+T細胞的表達Fig.2 The expression of CD4+CD25+T cells in AA model group

圖3 正常對照組CD4+CD25+T細胞的表達Fig.3 The expression of CD4+CD25+T cells in the normal control group

表4 AA大鼠肺功能與足跖腫脹度等各指標的相關性分析（r）Tab.4 Correlation analysis between lung function and paw swelling degree and each index in AA rats（r）

3 討論

類風濕關節炎不僅可以導致關節畸形,而且還常伴有關節以外的其他臟器病變,其中肺部病變是其常見病變之一。在既往研究中我們發現,RA患者IC 、MVV 、FVC、FEVI、FEF25、FEF50、FEF75、PEF 均明顯低于健康對照組（P＜0.05或P＜0.01）,肺功能損害以通氣功能障礙為主,并伴小氣道阻塞和肺容積減少[7,8]。本次研究發現,AA模型組與對照組相比,模型組用力肺活量（FVC）、25%肺活量的最大呼氣流量（FEF25）、50%肺活量的最大呼氣流量（FEF50）、75%肺活量的最大呼氣流量（FEF75）、最大呼氣中期流量（MMF）、用力最大呼氣流量（PEF）、肺動態順應性（Cldyn）較對照組明顯降低（P＜0.01）;1秒內的平均流量（FEV1/FVC）較對照組明顯升高（P＜0.01）。說明在AA模型中,大鼠肺功能損害仍表現為通氣功能障礙和小氣道阻塞,同時肺的順應性也減低。究其原因可能與細胞因子網絡失衡、信號傳導通道和免疫紊亂等一系列因素有關。

本組實驗研究表明,在AA模型中,免疫組化染色結果顯示,TGF-β1蛋白表達明顯高于空白對照組（P＜0.01）,TGF-β1在肺組織表達增高,具有顯著的促纖維化作用,刺激肺平滑肌細胞增生、肥大,誘導成纖維細胞向成肌纖維細胞轉化,促進細胞外基質蛋白合成和肺泡上皮細胞纖維化形成,從而參與肺組織結構的重建。同時,我們的研究還發現,在模型組中Smad3蛋白表達明顯升高,而Smad7蛋白表達降低,說明在AA模型致肺功能損害可能與Smad3、Smad7的共同調節有關。Smad3被TGF-β1分子激活后,反過來可以協同TGF-β1發揮分子學效應,這與對照組中TGF-β1、Smad3蛋白明顯降低相一致（P＜0.01）;同樣,在對照組中Smad7蛋白表達明顯升高（P＜0.01）,說明Smad7具有與其他信息分子不同的負性調節作用,Smad7可以抑制TGF-β1誘導的細胞凋亡、細胞外基質成分合成和沉積、纖維組織增殖和膠原合成分泌增加等。從而調節肺細胞增殖、活化,抑制肺成纖維細胞增殖,在阻止肺間質纖維化進一步發展中起關鍵作用。

本組實驗研究還表明,在AA模型組中Foxp3蛋白明顯低于對照組（P＜0.01）,且在與TGF-β1積分光密度Spearman相關分析可知,兩者呈負相關（r=-0.853,P＜0.01）,說明Foxp3與 TGF-β1/Smads信號傳導可能在AA肺功能損害中共同發揮作用。有研究表明TGF-β1能夠調節Foxp3表達[9],Foxp3是一種核轉錄因子,已被證明在CD4+CD25+調節性T細胞上特異性表達,在CD4+CD25+調節性T細胞的發育和功能上是必需的,Foxp3是Treg細胞的發生、發育以及發揮生物學活性的關鍵因素,在誘導和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性地位[10]。我們發現,與模型組相比,對照組CD4+CD25+T細胞百分率明顯升高,同時對照組中Foxp3蛋白表達水平也增加,Foxp3表達水平高的原因可能是功能性的,機體正常狀態下存在的自身反應性T細胞對自身抗原不發生反應,而在活躍期（AA模型組）Treg數量減少和功能缺陷,失去誘導CD4+CD25-T細胞的活化,從而不能導致CD4+CD25+調節性T細胞表達Foxp3增加。而高表達Foxp3的CD4+CD25+Tr細胞能夠產生大量的免疫抑制細胞因子如IL-10,然后通過細胞接觸及細胞表面TGF-β依賴性的方式對致病性T細胞直接發揮抑制功能,并使致病性T細胞對刺激的反應性降低,產生促炎因子減少。在AA模型中,TGF-β1蛋白表達增強,說明 TGF-β1可抑制T細胞的增殖;抑制B細胞合成IgE,誘導IgG4和IgA的產生[11]。

TGF-β1在炎癥的發生、發展中發揮著重大的作用,在損傷或炎癥早期,TGF-β1促進炎癥發展,且在炎癥部位活性增強,使成纖維細胞大量增殖,導致局部嚴重纖維化;TGF-β1具有廣泛的生物學特性,參與胚胎發育、組織修復、細胞周期調節等,亦在免疫調節方面發揮免疫抑制的作用。TGF-β1生物效應的發揮必須通過特定的信號傳導過程[4]。TGF-β1功能的發揮依賴于Smads蛋白的信號轉導及調控。Smads家族蛋白在將TGF-β1信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起到關鍵性作用,TGF-β1胞外激活后,與其胞膜上特異性受體（TβR-Ⅰ/Ⅱ）結合,繼而主要由Smads蛋白介導胞內信號傳遞。Smads蛋白家族是TGF-β1受體后信息分子,參與調控細胞的增殖、轉化、合成、分泌和凋亡。且不同的Smad介導不同的TGF-β家族成員的信號轉導。按功能Smad蛋白分為3類:即受體活化型或通路限制性Smad（R-Smads）、共同通路型Smad（Co-Smad）和抑制性Smad（I-Smads）。R-Smads能被Ⅰ型受體激活并與受體形成短暫復合物,它又分為兩類,即由激活素TGF-β激活的 AR-Smads,包括 Smad2、Smad3 和由BMP 等激活的 BR-Smads,包括 Smad1、Smad5、Smad8和Smad9;Co-Smad包括Smad4,是TGF-β家族各類信號傳導過程中共同需要的介質。I-Smads包括Smad6和Smad7,可與激活的Ⅰ型受體結合,抑制或調節TGF-β家族的信號轉導[12]。

在TGF-β1/Samds信號傳導通路中,TGF-β1作為配體形成的受體復合物,激活Smads進入核內,共同激活或抑制它們調節的靶基因（Foxp3）的轉錄。另一方面TGF-β1可作用于T淋巴細胞,使其Foxp3表達下調,TGF-β1在肺組織局部乃至全身能夠抑制CD4+CD25+調節性T細胞的生成,發揮抑制免疫的作用,從而導致AA肺功能損害。至于探討TGF-β1是如何通過一系列環節調節Foxp3表達的機制,還需要我們做進一步研究。

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[收稿2009-09-23]

（編輯 張曉舟）

Studies on the relationship between pulmonary function changesw ith Foxp3,TGF-β1/Smads signal transduction pathway in adjuvant arthritis rats

LIUJian,WANLei,SHENGChang-Jian,XIEXiu-Li.DepartmentofRheumatism,theFirstAffiliatedHospital,Anhui CollegeofTraditionalChineseMedicine,Hefei230031,Anhui,China

Objective:To observe the changes of lung index,lung function,regulatory T cells and Foxp3,TGF-β1,Smad3,Smad7 protein expression in adjuvantarthritis（AA）rats,and to investigate the possib lemechanism of Foxp3 and TGF-β/Smads signal transduction pathway in reducing lung function.Methods:24Wistar ratswere random ly divided into normal control group andmodel group,12 rats in each group.The ratswere injectedwith 0.1ml Freunds'complete adjuvant to induce inflammation at the partof their rightback foot inmodelgroup.On the48thday post-inflammatory,the swelling degree of toeand arthritis index（AI）were observed.Lung index of the ratswas calculated,and pulmonary function of the ratswas detected.The percentageof regulatory T cellswas determined,and pathological changesof the lungswas observed by HE staining.Foxp3,TGF-β1,Smad3,Smad7 p rotein expression in the lungs of the two groups of ratswas examined by immunohistochemistry.Results:①Compared with those of the normal,the swelling degreeof toes,AI,and the lung indexwere increased.The average peak expiratory flow in 1 second（FEV1/FVC）,alveolitis points,TGF-β1 and Smad3 protein expression was significantly higher in the AA model group rats（P＜0.01）.Forced vital capacity（FVC）,25%of vital capacity of the peak expiratory flow（FEF25）,50%of vital capacity of the peak expiratory flow（FEF50）,75%of vital capacity of the peak expiratory flow（FEF75）,maximum mid-expiratory flow（MMF）,forcedmaximal expiratory flow（PEF）,pu lmonary dynamic compliance（Cldyn）,the percentage of CD4+T cell,CD25+T cell,CD4+CD25+T cell,Foxp3 and Smad7 protein exp ressionwasobviously lower in the AA model group rats（P＜0.01）.②FEF50,Cldyn and MMFwerenegative cor-related with the swelling degreeof toes,pulmonary coefficientand TGF-β1.FEF50,FEF75,MMF and FEV1/FVCwere positiyely correlatedwith the arthritis index,pulmonary coefficientand Foxp3（P＜0.05 orP＜0.01）.Conclusion:The decline in lung function in AA rats.Tip-induced may be sustained after the inflammation,and the developmentof cause inflammation,to chronic inflammatory response leading to lung injury.Simultaneously,the decline in lung function and Foxp3.Smad3,Smad7,TGF-β1 protein expression was associated.Description transcription factor Foxp3 and TGF-β1/Smads signal transducation pathwaymay participate in themechanism.

Adjuvantarthritis;Pu lmonary function;Foxp3 protein;TGF-β/Smads signal transduction pathway

R593.22

A

1000-484X（2010）03-0258-06

①本文為國家中醫藥管理局科研課題專項基金（04-05LP27）、安徽省十一五攻關項目（07010300204）、安徽科技重點研究項目（06023068）、安徽中醫內科應用基礎與開發研究省級實驗室項目（科條[2008]150號）、安徽省教育廳自然科學重點科研項目（KJ2008A 165）

②安徽中醫學院2007級研究生,合肥 230031

劉 健（1964年-）,男,醫學博士,教授,主任醫師,博士生導師,主要從事中醫藥防治風濕病研究,E-mail:liujianahzy@yahoo.com.cn。