跌打止痛巴布劑中蛇床子、獨活、川芎等藥味的鑒別研究

劉新國， 周莉玲， 郭麗蓉

(廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006)

跌打止痛巴布劑是將蛇床子、獨活、川芎、大黃等七十七味中藥經超臨界二氧化碳萃取后，加入丁香羅勒油、桂皮油等九味揮發油制成的水凝膠型膏貼劑，具有活血化瘀、消腫止血、行氣止痛、收斂生肌的功效，對治療跌打損傷、火傷燙傷、刀傷出血具有顯著的作用。本方成分復雜，藥味間相互干擾大，制劑質量控制難度較大。本實驗根據貼膏劑下巴布劑制劑通則，結合跌打止痛巴布劑自身特點，采用薄層色譜法和氣相色譜法鑒別方中主要藥味，方法簡便易行，準確可靠，可有效控制制劑質量，為今后含揮發油膏貼劑型的研究及揮發性成分含量測定提供參考。

1 儀器與試藥

ZF－I型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)，Agilent 6890N氣相色譜儀(安捷倫)及配套工作站，石英毛細管柱(phenomenex ZB－WAX，長 30 m，內徑 0.32 mm ，涂層 0.5 μm)。

蛇床子對照藥材(批號121030－200405)、獨活對照藥材(批號120940－200809)、川芎對照藥材(批號120918－200809)、大黃對照藥材(批號 120902－200609)、蛇床子素對照品(批號 110822－200406)、大黃酚對照品(批號 110796－200716)、桉油精對照品(批號 110788－200903)、樟腦對照品(批號 747－200606)、薄荷腦對照品(批號 0728－00005)、異龍腦對照品(批號 1512－200201)、龍腦對照品(批號 110881－200202)、水楊酸甲酯對照品(批號 110707－200107)、茴香醛對照品(批號 1545－200001)、桂皮醛對照品(批號 110710－200714)、丁香酚對照品(批號 725－200209)，以上對照藥材與對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，萘(純度＞99%，sigma)，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

跌打止痛巴布劑(廣州敬修堂藥廠，批號:081116、081117、081118，規格:10 cm ×6 cm，含膏量6 g/片)。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 蛇床子、獨活鑒別

2.1.1.1 供試品溶液制備 取本品5片，剪成寬約1 cm條帶狀，揭去蓋襯，加甲醇150 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至10 mL，殘液加水20 mL，用乙醚分兩次萃取，每次30 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對照藥材溶液制備 取蛇床子、獨活對照藥材各0.3 g，分別加無水乙醇5 mL，超聲處理10 min，濾過，取續濾液作為對照藥材溶液。

2.1.1.3 對照品溶液制備 取蛇床子素對照品，加無水乙醇制成1 mL含0.1 mg溶液。

2.1.1.4 陰性對照溶液制備 取缺蛇床子和獨活的陰性樣品，同蛇床子、獨活供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.1.1.5 照薄層色譜法(中國藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗 精密吸取上述4種溶液各6 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－甲苯－乙酸乙酯(2∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

2.1.2 川芎薄層鑒別

2.1.2.1 供試品溶液制備 取本品10片，剪成寬約1 cm條帶狀，除去蓋襯，加甲醇300 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，殘液加乙醚100 mL，置水浴上回流提取兩次，每次30 min，合并乙醚層，揮干，殘渣加乙酸乙酯1mL溶解，作為供試品溶液。

2.1.2.2 對照藥材溶液制備 取川芎對照藥材0.5 g，加甲醇25 mL，超聲處理10 min，濾過，取續濾液作為對照藥材溶液。

圖1 蛇床子素的薄層鑒別

2.1.2.3 陰性對照溶液 取缺川芎的陰性樣品，同川芎鑒別供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。

2.1.2.4 精密吸取上述3種溶液各6 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應位置，顯現相同顏色斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

圖2 川芎的薄層鑒別

2.1.3 大黃薄層鑒別

2.1.3.1 供試品溶液制備 取本品10片，剪成寬約1 cm條帶狀，除去蓋襯，加甲醇300 mL，浸漬1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，殘液加水90 mL，再加鹽酸9 mL，置水浴上加熱30 min，立即冷卻，用乙醚分兩次萃取，每次150 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.3.2 對照藥材溶液制備 取大黃對照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，濾液揮干，殘渣加水10 mL溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分兩次萃取，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.3.3 對照品溶液制備 取大黃酚對照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3.4 陰性對照溶液制備 取缺大黃的陰性樣品，同大黃鑒別供試品溶液制備方法處理，制成大黃陰性對照溶液。

2.1.3.5 精密吸取上述4種溶液各6 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G板上，以正己烷－乙酸乙酯(6∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣飽和展開槽中顯色至斑點清晰，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品色譜相應位置上，顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

圖3 大黃的薄層鑒別

2.1.4 薄層鑒別方法耐用性考察

2.1.4.1 不同薄層板的比較 以上3個薄層鑒別試驗，以羧甲基纖維素鈉為黏合劑手鋪硅膠G薄層板鑒別效果均優于預制硅膠G板。

2.1.4.2 不同濕度的比較 取點樣后的薄層板分別于濕度22%和75%的層析缸中展開，顯色，檢視。結果表明在相對濕度22%～75%之間，鑒別效果均無明顯變化。

2.1.4.3 不同溫度的比較 取點樣后的薄層板分別在4℃和30℃條件下展開，顯色，檢視。結果表明在4℃ ～30℃溫度范圍內對鑒別效果均無明顯影響。

2.2 氣相色譜鑒別

2.2.1 混合對照品貯備液的制備 精密稱取桉油精、樟腦、薄荷腦、異龍腦、龍腦、水楊酸甲酯、茴香醛、桂皮醛、丁香酚對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得。

2.2.2 內標溶液 取萘適量，精密稱定，加無水乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 精密量取混合對照品貯備液和內標溶液各250 μL，至10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 供試品溶液 取跌打止痛巴布劑5片(含藥膏30 g)，剪成1 cm寬小條，去除蓋襯，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，連接揮發油提取器，自提取器上端加水使充滿刻度，并溢流入燒瓶為止。連接回流冷凝管，加熱回流5 h，放冷，分取油層，用鋪有無水硫酸鈉的漏斗濾過，精密稱定重量。從中精密稱取揮發油100 μg，加入內標溶液250 μL，無水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.2.5 陰性對照溶液制備 取缺桉油、樟腦、薄荷油、冰片、水楊酸甲酯、八角茴香油、桂皮油、丁香羅勒油的陰性樣品，按供試品溶液相同方法處理，制成溶液。

2.2.6 色譜條件 以石英毛細管柱為色譜柱，柱溫為程序升溫，80℃保持2min后開始升溫，以5℃/min升溫至140℃，保持8 min，再以12℃/min升溫至220℃;進樣口溫度為210℃;檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度為245℃;載氣為高純氮氣，流速:1 mL/min;進樣量為1 μL;分流比40∶1;理論板數按丁香酚峰計算不低于50 000。

按上述色譜條件，分別取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照溶液1μL進樣測定，采用相對保留值法進行色譜峰的指認。從結果可以看出，各指標峰之間分離良好，供試品溶液相對保留時間與對照品溶液相對保留時間出現相應特征峰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖4～圖6。

圖4 供試品溶液色譜圖

圖5 混合對照品溶液色譜圖

3 討論

3.1 按2005版《中國藥典》收載大黃藥材薄層鑒別項目，365 nm紫外光下應檢視到五個暗紅色斑點，按Rf值從小到大依次為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚。而跌打止痛巴布劑所采用超臨界二氧化碳萃取技術主要是針對極性較小成分進行萃取，薄層色譜圖中雖未發現大黃酚以外大黃成分，但鑒別結果并無干擾，且試驗結果與采用《中國藥典》大黃鑒別方法所得結果一致，因此采用上述方法鑒別方中大黃成分還是可行的。

圖6 陰性對照溶液色譜圖

3.2 在揮發性成分氣相色譜鑒別過程中，供試品溶液制備曾采用甲醇冷浸法提取，提取液經0.45 μm微孔濾膜過濾后直接作為供試品溶液。但這種浸提方法所得供試液體積大，雜質成分多，巴布劑基質中甘油也被一并提出，影響色譜柱壽命，給氣相分離帶來很大困難，故未予采用。

3.3 內標物的選擇，曾嘗試用正十六烷、環己酮作內標，由于色譜峰分離效果和保留時間差異等原因未予采用。

本研究不僅在同一氣相色譜條件下鑒別出跌打止痛巴布劑中多個揮發性成分，更重要是為外用膏貼劑中揮發性成分含量測定提供合適的內標物和方法學的參考。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:附錄57.

［2］孟 舒，陳再興，姜 泓，等.玄丹巴布劑質量標準研究［J］.中國現代應用藥學雜志，2007，24(5):394－396.