蒼術(shù)GC指紋圖譜研究

呂美紅， 嚴(yán)啟新， 梁 慧， 李 勇， 馮漢林， 謝曉梅

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230031;2.深圳海王生物工程股份有限公司，廣東 深圳518057)

蒼術(shù)(Rhizoma Atractylodis)為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北蒼術(shù) Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根莖，性溫，味辛、苦，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有燥濕健脾，祛風(fēng)散寒，明目之功效［1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蒼術(shù)具有抗炎抗菌［2］、降糖、利尿、抗?jié)儭⒋龠M(jìn)胃排空、調(diào)節(jié)腸免疫功能［3］、抗心率失常及心肌保護(hù)［4］等作用，與大多數(shù)中藥材一樣，其藥理活性復(fù)雜，藥效不是來(lái)自任何單一活性成分。蒼術(shù)中的主要成分為揮發(fā)油和苷類(lèi)成分。傳統(tǒng)中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法是對(duì)某一化學(xué)成分進(jìn)行定性或定量分析，而對(duì)大多數(shù)中藥來(lái)說(shuō)，任何單一活性成分或指標(biāo)成分都難以全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，因此，本實(shí)驗(yàn)采用GC法建立蒼術(shù)的指紋圖譜，在14批樣品測(cè)定的基礎(chǔ)上，初步總結(jié)出不同產(chǎn)地蒼術(shù)指紋圖譜的共性，為其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent6890 N氣相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司);氫火焰離子化檢測(cè)器;AG135型電子天平(METTLER TOLEDO);KQ－300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);正十五醇 (Sigma－Aldrich Traning Co.，Ltd，純度為99%);乙酸乙酯(色譜純);水為重蒸水;其它試劑均為分析純;蒼術(shù)藥材與飲片來(lái)自江蘇、湖北、吉林、內(nèi)蒙、陜西、安徽等地，2008年或2009年收集，均經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥教研室彭華勝副教授鑒定，樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 蒼術(shù)樣品的來(lái)源Tab 1 Sources of Rhizoma Atractylodis samples collected

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:HP－INNOWax Polyethylene Glycol(30.0 m×0.32 mm×0.5 μm)石英毛細(xì)管柱，氫火焰離子化檢測(cè)器，氣化室溫度:270℃，柱溫:185℃，檢測(cè)器溫度:280℃，載氣為氮?dú)猓魉?25 mL/min，空氣流速:380 mL/min，氫氣流速:40 mL/min，柱前壓為4.14×104Pa。

2.2 參照物溶液的制備 采用正十五醇(內(nèi)標(biāo))為參照物，精密稱(chēng)定0.40 g，置1 000 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解，并稀釋至刻度，作為參照物溶液(每1 mL中約含正十五醇0.40 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取蒼術(shù)過(guò)2號(hào)篩藥材粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯25 mL，40℃超聲(功率300 W，頻率40 kHz)提取15 min，過(guò)濾，濾渣再加乙酸乙酯25 mL，同法處理，合并兩次濾液，蒸干，殘?jiān)蒙鲜鰠⒄瘴锶芤喝芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜即得供試品溶液。

2.4 測(cè)定方法 分別將各批藥材與飲片的供試品溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 空白試驗(yàn) 取乙酸乙酯注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 空白試驗(yàn)色譜圖Fig.1 GC chromatograms of blank solution

2.5.2 對(duì)照試驗(yàn) 取參照物溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照試驗(yàn)色譜圖Fig.2 GC chromatograms of control solution

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液(樣品編號(hào)12)，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD小于2.89%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于1.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(樣品編號(hào)12)過(guò)2號(hào)篩粉末約0.5 g，精密稱(chēng)定，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積的 RSD小于2.96%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.86%，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

圖3 蒼術(shù)氣相指紋圖譜Fig.3 The GC fingerprinting of Rhizoma Atractylodis

2.7 指紋圖譜的分析與評(píng)價(jià)

2.7.1 共有指紋峰的標(biāo)定 將參照物峰保留時(shí)間作為1，計(jì)算其它各共有峰與參照物峰間保留時(shí)間的比值，從而得出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)比較14批蒼術(shù)樣品色譜圖和相對(duì)保留時(shí)間，發(fā)現(xiàn)其中10個(gè)峰是各批供試品所共有，保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，因此確定這10個(gè)峰為共有指紋

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(樣品編號(hào)12)，分別于 0、2、4、8、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積基本一致，RSD小于1.98%，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于0.78%，表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜的要求。

圖4 不同產(chǎn)地蒼術(shù)氣相指紋圖譜Fig.4 The GC fingerprinting of Rhizoma Atractylodis from different habitats

2.6 指紋圖譜的建立 取供試品溶液適量注入氣相色譜儀，在同一選定的色譜條件下檢測(cè)14批樣品。蒼術(shù)指紋圖譜與不同產(chǎn)地樣品指紋圖譜見(jiàn)圖3～4。峰。并通過(guò)對(duì)照，峰S為參照物正十五醇的峰，其保留時(shí)間為26.8 min，7、8號(hào)共有峰分別為茅術(shù)醇與 β－桉葉醇，其保留時(shí)間分別為22.1、24.9 min。且此兩峰在各批樣品指紋圖譜中峰高較高，面積較大，含量較高，為主成分峰，因此在各批樣品中較易被檢出，可作為含量測(cè)定時(shí)的指標(biāo)成分。

表2 14批蒼術(shù)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 2 Relative retention times of common peaks for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

2.7.2 共有指紋峰面積的分析 將參照物峰面積作為1，計(jì)算其它各共有峰與參照物峰間的面積比，從而得出各共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)比較蒼術(shù)各批樣品指紋圖譜中共有峰的峰面積，可知各共有峰相對(duì)峰面積差異較大，表明不同產(chǎn)地的蒼術(shù)藥材與飲片中共有成分的含量存在顯著差異，14號(hào)樣品(陜西)的兩主成分色譜峰7、8的峰面積最大，同時(shí)即使是同一產(chǎn)地，如樣品1～4號(hào)，其產(chǎn)地相同，但其含量仍存在顯著差異，樣品10與11號(hào)也是如此，但在各批藥材指紋圖譜中，各共有峰的面積之和大于總體峰面積的90%。2.7.3 非共有峰的分析 本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的14批藥材與飲片中，除上述10個(gè)共有峰外，各自指紋圖譜中還存在非共有峰，總體上來(lái)看，各批樣品中非共有峰所占面積比例較小，不過(guò)10%，而且各自非共有峰的峰數(shù)也各不相同，這表明各批樣品由于產(chǎn)地、生長(zhǎng)環(huán)境等不同，在成分組成上除上述主要共有成分外，還是存在一定差異，其中4號(hào)樣品非共有峰數(shù)目最少，14號(hào)樣品非共有峰數(shù)目最多，表明4號(hào)樣品成分組成最為簡(jiǎn)單，14號(hào)樣品成分組成最為復(fù)雜;2號(hào)樣品非共有峰所占面積比最大，12號(hào)樣品非共有峰所占面積比最小，表明2號(hào)樣品非共有成分含量所占比例最高，12號(hào)樣品非共有成分含量所占比例最低。14批樣品峰總數(shù)與非共有峰所占面積比見(jiàn)表4。

表3 14批蒼術(shù)共有峰的相對(duì)峰面積Tab 3 Relative peak area of common peaks for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

表4 14批蒼術(shù)非共有峰面積比Tab 4 Peaks area ratio of non-common for fourteen batches of Rhizoma Atractylodis

2.7.4 相似度評(píng)價(jià) 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版”(藥典委員會(huì))，以12號(hào)湖北產(chǎn)蒼術(shù)樣品色譜圖作為參照?qǐng)D譜進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果14批蒼術(shù)藥材與飲片中，相似度值在0.992～0.688間，大部分樣品相似度較高，但仍不能直接建立蒼術(shù)指紋圖譜的共有模式，需對(duì)蒼術(shù)各藥材與飲片進(jìn)行進(jìn)一步樣品間差異的評(píng)價(jià)，進(jìn)行圖譜模式識(shí)別分類(lèi)，以便最終能夠建立真實(shí)可靠的蒼術(shù)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

3 討論

3.1 參照物溶液的制備 本實(shí)驗(yàn)選用了從正十一醇至正十五醇以及它們所對(duì)應(yīng)的烷烴等作為參照物進(jìn)行試驗(yàn)，最終確定采用以正十五醇為參照物，其保留時(shí)間約為26.8 min，與樣品各峰互不干擾，峰位穩(wěn)定，分離度符合要求，基線(xiàn)平穩(wěn)，重復(fù)性也好。

3.2 色譜柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)試用了HP－INNOWax Polyethylene Glycol(30.0 m ×0.32 mm × 0.5 μm)、HP－5(30.0 m ×0.32 mm ×0.25 μm)等石英毛細(xì)管柱，最終在 HP－INNOWax Polyethy－lene Glycol(30.0 m ×0.32 mm ×0.5 μm)柱上各批樣品供試液均能得到較好分離，出峰時(shí)間穩(wěn)定適中，且峰數(shù)較多，故本實(shí)驗(yàn)選用此柱。

3.3 指紋圖譜的建立意義 本實(shí)驗(yàn)初步建立了蒼術(shù)的指紋圖譜，在有限樣本的測(cè)定基礎(chǔ)上，共找出了10個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中兩個(gè)含量較高的成分峰——茅術(shù)醇與β－桉葉醇，所得的指紋圖譜多個(gè)成分間分離效果良好，能夠較全面地反應(yīng)蒼術(shù)藥材與飲片的內(nèi)在質(zhì)量，符合中藥質(zhì)量控制的整體性、復(fù)雜性和全面性的要求，為控制蒼術(shù)內(nèi)在質(zhì)量提供了依據(jù)。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:111.

［2］肖 洋，張凌贏，華 芳，等.蒼術(shù)提取液對(duì)銅綠假單胞菌R質(zhì)粒體內(nèi)體外消除作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2002，22:216.

［3］Yu K W，Kiyohara H，Matsumoto T，et al.Structural characterization of intestinal immune system modulating new arabino－3，6－galactan from rhizomes of Atractylodes lancea DC ［J］.Carbohydr Polym，2001，46:147.

［4］朱惠京，張紅英，馬玉蓮，等.關(guān)蒼術(shù)正丁醇萃取物對(duì)大鼠心肌缺血及缺血－再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2000，7(3):173.