丹參藥材-中間體-丹參片的HPLC指紋圖譜及其相關性研究

張 聰， 韓曉錦

(1.上海市中藥研究所，上海200002;2.上海中醫藥大學，上海201203)

丹參片是由丹參藥材提取制成的單方制劑，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞等癥，有顯著療效，為了提高丹參片質量控制水平，因此對其生產工藝進行分析研究，控制和提高丹參片質量。

就目前中藥指紋圖譜的發展現狀來看，主要運用在原料藥材和制劑中較多，而在對生產過程中中間體的分析較少，而中間體是原料藥到成藥的轉化過程中的橋梁，對藥材有效成分的轉移率有很大的影響，因此從原料藥材選擇抓起，同時控制中間體和成品的質量，對生產工藝過程進行規范和改進，是從整體上系統地控制并提高藥品質量的有效途徑［1］。中藥指紋圖譜的具有系統性、特征性和穩定性［2］，是一種綜合的，可量化的鑒別手段。

1 儀器、試劑與材料

1.1 樣品來源

本實驗收集了山東河南陜西浙江等產地的26批丹參藥材，經上海華宇藥業公司鑒定為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖。丹參片中間體和丹參片均由上海雷允上制藥總廠提供。見表1～2。

表1 丹參藥材的批號及產地

表2 丹參中間體、丹參片的批號

1.2 儀器與試劑

Agilent1200色譜儀:DegasserG1322A;QuatPump G1311A;ALS G1329A;Column GCC G1316A;Detector G1314B島津高效液相色譜儀:Degasser DGU-12A;Liquid Chromatograph LC-10AT VP;System Controller SCL-10A VP;Column OVEN CTO-10A VP;UV-VIS Detector SPD-10A VP，紫外分析儀:Shimadzu UV-2401PC乙腈(色譜純);甲酸(分析純);甲醇(色譜純分析純);水(雙蒸水)。

1.3 對照品

丹參素鈉(110855-200508)，咖啡酸(885-200001)，異阿魏酸(111698-200602)，丹酚酸B(111562-200605)，隱丹參酮(110852-200305)，丹參酮Ⅰ(0867-200205)，丹參酮ⅡA(110766-200518)均購自中國藥品生物制品檢定所，迷迭香酸(070602)，丹酚酸A(07802)均購自上海融禾醫藥科技有限公司，紫草酸(ZZF070915)購自上海友思生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 丹參藥材溶液的制備

丹參藥材在放有五氧化二磷的真空干燥箱中干燥，然后打粉，過三號篩。精密稱取丹參藥材粉末(過三號篩)1 g，置50 mL的量瓶中，用70%甲醇超聲提取1 h［3-5］，放置至室溫定容，放置過夜，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.1.2 丹參中間體溶液的制備

精密稱取丹參中間體粉末(過三號篩)1 g，置于50 mL的量瓶中，用70%甲醇超聲提取1 h，靜置，定容，放置過夜，取上清液0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.1.3 丹參片溶液的制備

取同一批號的丹參片20片，打粉，精密稱取丹參片粉末(過三號篩)1 g，置于50 mL量瓶中，用70%甲醇超聲提取1 h，靜置，定容，放置過夜，取上清液0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備

精密稱取在五氧化二磷真空干燥至恒重對照品，置于20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。

2.2 色譜條件

Agilent Zorbax Extand Reversed-Phase C18column［6-10，14］(5 μm，250 mm × 4.6 mm)色譜柱;流動相［11-15］:乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)，流速:1.0 mL/min，進樣量:10 μL，檢測波長280 nm，柱溫:30℃。線性梯度洗脫程序為［6，16-23］:開始時0 min 10%A，10～20 min 20%A，40 min 30%A，45 min 35%A，55 min 42%A，75 min 55%A，85 min 65%A，92 min 70%A，102 min 80%A，112 min 100%A，色譜峰記錄時間為120 min。對照品HPLC圖譜見圖1。

圖1 對照品HPLC色譜圖

3 數據處理

Spss(13.0)統計分析軟件;國家藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004年A版)

4 結果和討論

4.1 丹參藥材的指紋圖譜研究

4.1.1 丹參藥材的指紋圖譜建立

將供試品溶液按選定的色譜條件測定，得到26批樣品的圖譜，建立的指紋圖譜共有31個共有峰。26批供試品色譜圖中十二強峰峰面積占總峰面積的百分比見表3。

4.1.2 丹參藥材指紋圖譜的相似度計算

采用國家藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004年A版)，對所得的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，結果見表4。

表3 26批藥材的總峰數、共有峰占總峰數的比例、十二強峰峰面積占總峰面積的百分比

表4 不同產地的26批的丹參藥材的指紋圖譜相似度計算結果

4.1.3 結果

本實驗用HPLC法梯度洗脫研究了不同產地不同批次的丹參藥材的HPLC指紋圖譜，其供試品的精密度、穩定性、重復性均良好。26批不同產地的丹參藥材樣品指紋圖譜的特征性較強，共有31個共有峰，每個藥材的十二強峰的峰面積和占總的峰面積值均在80%以上的有25個，其中只有11號稍低于80%;26批丹參藥材中只有5號和25號樣品的特征指紋峰檢出率稍低于90%，其他藥材的特征指紋峰檢出率都較高，在90%以上，符合要求。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004年A版)對26批次藥材色譜圖之間的相似度進行了研究，各個藥材之間的相似度達到了0.893以上，但其中11 號藥材與2、5、6、10、12、13、16、18、21、22、23、24、25、26號藥材的相似度在0.950～0.893之間，相似度稍低，其他的藥材間的相似度均高于0.950，符合國家對藥材指紋圖譜研究技術要求的規定，也確定了該實驗方法使用的可行性，可用其對丹參藥材進行鑒別和質量控制。

4.2 丹參中間體的指紋圖譜研究的建立

4.2.1 丹參中間體的指紋圖譜建立

將供試品溶液按選定的色譜條件測定，得到12批樣品的圖譜，建立的指紋圖譜共有80個共有峰。12批供試品色譜圖中十二強峰峰面積占總峰面積的百分比見表5。

4.2.2 丹參中間體指紋圖譜的相似度計算

采用國家藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004年A版)，對所得的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，結果見表6。

表6 12個不同批號的丹參中間體的指紋圖譜相似度計算結果

4.2.3 結果

本實驗建立了不同批次丹參中間體的HPLC指紋圖譜，12批丹參中間體共有80個共有峰;每個丹參中間體的十二強峰的峰面積和占總的峰面積值均在70%以上;其特征指紋峰的檢出率均高于90%，符合要求。其相似度研究表明各個中間體之間的相似度達到0.987以上，及相對保留時間和峰面積的RSD差異不明顯也說明不同批次丹參中間體間的化學成分有較好的一致性和穩定性，因此我們通過建立丹參中間體指紋圖譜庫，從而實現通過控制中間體質量和穩定性來控制成品的質量，為方便、快速、準確地控制藥品質量提供良好的方法。

4.3 丹參片的指紋圖譜的建立

4.3.1 丹參片的指紋圖譜建立

將供試品溶液按選定的色譜條件測定，得到20批樣品的圖譜。20批供試品色譜圖中十二強峰峰面積占總峰面積的百分比見表7。

表7 20批丹參片的總峰數、共有峰占總峰數的比例、十二強峰峰面積占總峰面積的百分比

4.3.2 丹參片指紋圖譜的相似度計算

采用國家藥典委員會出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2004年A版)，對所得的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，結果見表8。

4.3.3 結果

本實驗建立了20批丹參片的HPLC指紋圖譜，共獲得52個共有峰(包括10個對照品的峰)，每個丹參片的十二強峰的峰面積和占總的峰面積值均在60%以上;20批丹參片中，其中1號、9號和17號的特征指紋峰檢出率分別84.38%、82.81%、79.37%低于90%外，其他樣品的特征指紋峰檢出率均在90%以上。對20批丹參片色譜圖之間的相似度進行研究，各個丹參片之間的相似度均達到了0.953以上。由上可知，部分丹參片檢出率稍低可能是提取時間和提取溫度及其pH的不同造成的，與它醇沉水提的工藝有密不可分的聯系，有待進一步驗證和研究。但并沒有對藥品質量造成明顯影響，所生產藥品還是符合要求的。

表8 同一廠家20個不同批號的丹參片指紋圖譜相似度計算結果

5 丹參藥材-丹參中間體-丹參片HPLC圖譜的相關性分析

5.1 丹參藥材-中間體-丹參片指紋圖譜相似度分析［24］

分別取5批丹參藥材，及相應的5批丹參中間體及相應的14批丹參片，按照擬定的方法測定其HPLC圖譜，采用相似度評價軟件分別對原藥材、中間體、片劑進行全譜的相似度評價及共有圖譜擬合［25-27］，分別得到其共有指紋圖譜見圖2，結果見表9～13。

圖2 藥材批號為091001的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度示意圖

表9 藥材批號為091001的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度計算結果

藥材批號為091001的丹參片，從原藥材、中間體、到片劑共有47個共有峰(包括10個對照品的峰)，他們之間的相似度在0.971～0.999之間，其化學成分相關性較好。

表10 藥材批號為091002的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度計算結果

批號為091002的丹參片，從原藥材、中間體、到片劑共有44個共有峰(包括10個對照品的峰)，原藥材-中間體的相似度均在0.965～0.999之間，相關性較好，但是原藥材和中間體與丹參片的相似度較小，不符合要求，可能是提取的時間和提取溫度及其pH值不同的原因，但尚未確定，需要進一步研究。

表11 藥材批號為091003的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度計算結果

批號為091003的丹參片，從原藥材、中間體、到片劑共有35個共有峰(包括10個對照品的峰)，其相似度均在0.978～1.000之間，其化學成分相關性較好。

表12 藥材批號為091004的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度計算結果

批號為091004的丹參片從原藥材、中間體、片劑共有33個共有峰(包括10個對照品的峰)，其之間的相似度在0.974～0.999以上，從藥材到中間體浸膏到制劑，其化學成分相關性較好。

表13 藥材批號為091005的丹參藥材-中間體-丹參片的指紋圖譜相似度計算結果

藥材批號為091005的丹參片的從原藥材、中間體、丹參片共有29個共有峰(包括10個對照品的峰)，原藥材、中間體的相似度均在0.980以上，3個對應批號的丹參片的相似度在0.986以上，但是處方藥材和中間體與丹參片的相似度很小，說明之間差異很大。與上面批號為091002的樣品出現了同樣的問題，這可能與提取溶劑有關，也可能和提取過程的操作有關，都有待進一步驗證并找出問題所在。

5.2 10個對照品在丹參藥材-中間體-丹參片中的含量變化

在丹參片生產過程中，生藥浸膏比為1 g生藥得到0.6 g的中間體浸膏，生藥成品比為1 g生藥得到0.3 g的成品。見圖5與表14。

圖5 10個對照品在批號091001丹參藥材-中間體-丹參片中含量變化

表14 10個對照品在5批丹參藥材-中間體-丹參片中含量變化(mg/g)

5.3 討論

對丹參藥材、中間體、丹參片的指紋圖譜進行相似度分析，結果顯示 091001、091003、091004 3 批的藥材-中間體-片劑的相似度均高于0.970，相關性良好，但091002和091005中，藥材-中間體的相似度在0.965～1.000之間和0.985～1.000之間，相關性良好，但是兩者與片劑的相似度卻相當低，總結原因可能是以下兩個因素:一是受片劑生產過程中加入輔料的影響，二是可能是不同時間做實驗時的流動相pH值的影響，導致出峰時間的稍微改變。也可能是生產過程的其他因素引起的，有待進一步研究，這也同時反映了生產過程存在的某些問題，需要我們去尋找發現解決。

將丹參藥材，中間體，片劑的共有指紋圖譜進行重疊比較，發現丹參藥材中的主要的有效組分的色譜峰在中間體及成品的色譜圖中都有所體現，而中間體和成品中的主要色譜峰也能在藥材的圖譜中找到追溯，但是原料藥材中水溶性成分在生產過程中損失較少，其中丹參素鈉，咖啡酸，異阿魏酸，紫草酸在生產過程中損失較少，迷迭香酸，丹酚酸B，丹酚酸A在藥材到中間體的過程中損失較少，而在到片劑過程中損失較多;脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA在藥材-中間體的過程中損失較多，到片劑過程損失較少。有些脂溶性成分由于本身含量較少及自身的不穩定性，在生產過程中發生了丟失，因此改進和提高生產工藝是非常必要和有效的。

通過對化學成分及其穩定性的研究，揭示了中藥制劑與原藥材和中間體的基源相關性，其中中間體及成品與原藥材的指紋圖譜間的差異主要是由中間體前的工藝過程中產生的，提取條件和提取方法的統一是使中間體和片劑與藥材在成分上統一和穩定的關鍵因素，統一和完善提取工藝是用來較好的控制丹參片的質量有效方法，能實現最終產品質量的一致性和穩定性，并為提高藥品質量提供依據和參考。

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