三黃片專屬性近紅外定量分析模型的建立初探

徐東來， 莫 迎

(南寧食品藥品檢驗所，廣西南寧450001)

三黃片由大黃、鹽酸小檗堿、黃芩浸膏組成，具有清熱解毒，瀉火通便的功效。主要用于三焦熱盛所至的目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、牙齦腫痛、心煩口渴、尿黃、便秘;急性胃腸炎，痢疾等［1］。其主要有效成分之一的鹽酸小檗堿，其測定方法是按《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編》(2003年 －2008年)［2］的 HPLC 進行測定，該方法需要一系列的樣品前處理工作、大量的試劑和熟練的操作人員。近紅外漫反射光譜法不需要對樣品進行破壞、不用試劑、不污染環境，分析速度快，結果準確，操作技術要求低［3］10，近兩年來近紅外漫反射光譜法已廣泛地應用到藥品檢測車上對藥品進行初篩，本實驗以HPLC為參比方法，首次用近紅外漫反射法測定9家不同企業的樣品，建立了測定三黃片中鹽酸小檗堿含量的專屬性校正模型，對應用NIR法進行中成藥快速分析的可能性進行了初步探討。

1 儀器

Matrix-F型傅立葉變換近紅外光譜儀(德國BRUKER公司)。

2 樣品

52批三黃片為2008年與2009年南寧食品藥品檢驗所監督抽驗樣品。

3 實驗方法

3.1 三黃片中鹽酸小檗堿的含量 按《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編》(2003年－2008年)［2］的HPLC進行測定，以三黃片單位片重(mg)中所含的鹽酸小檗堿質量(mg)表征三黃片的含量(%)。

3.2 NIR光譜采集 取樣品，磨去外層的糖衣層，用光纖探頭直接抵住片劑已除去糖衣的部位掃描，以儀器內置背景為參比，掃描波長范圍為12 000～4 000 cm－1，分辨率為 8 cm－1，掃描次數為 64 次;每批樣品隨機抽取6片，每片按上述儀器參數測定1次，對每批樣品計算平均光譜。

3.3 訓練集樣本 選取6個企業的36批編號為01、02、03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、29、36、37、38、39、41、42、44、45、46、48、49、50、52 的樣品作為訓練集，含鹽酸小檗堿的純度范圍從0.713 3%～2.188 0%。

3.4 驗證集樣本 選取3個企業16批編號為09、14、15、16、23、28、30、31、32、33、34、35、40、43、47、51的樣本作為驗證集，含鹽酸小檗堿的純度范圍從0.833 1% ～2.065 8%。

對訓練集樣品光譜數據用矢量歸一化(Vector Normalization)進行預處理，運用偏最小二乘法(PLS)建立校正模型［3］44-46。所有數據處理均使用儀器自帶的OPUS 5.0軟件進行。

4 結果與討論

4.1 近紅外模型的建立 比較三黃片、鹽酸小檗堿片(作為對照品)的原始NIRDRS光譜圖(見圖1)可知，由于所含鹽酸小檗堿的濃度不同，因此，選取差異性大的特定譜段、適當的光譜預處理方法及合理的化學計量學方法以突出活性成分的信息是建立三黃片專屬性NIR定量模型的關鍵。

圖1 鹽酸小檗堿片(1)、52個三黃片樣品(2)的原始NIR光譜Fig.1 NIR spectra of berberine hydrochloride tablets(1)，52 batches of samples of Sanhuang Tablets(2)

4.1.1 訓練集樣本的選擇 本文將收集到的9家生產企業52個三黃片市售樣本的近紅外光譜圖進行聚類分析(預處理方法:一階導數－矢量歸一;譜區范圍:12 000～4 000 cm－1)(見圖2)，在 0.28處可將全部樣本分為9大類，從每大類中分別取出2～4樣本共計36個樣本組成訓練集，純度范圍為0.713 3%～2.188 0%，用于建立模型;剩余的 16個樣本組成驗證集，純度范圍為0.833 1% ～2.065 8%，用于模型的預測。

4.1.2 建立NIR模型 采用PLS法，利用OPUS軟件Quant-2中的所有的預處理方法并應用其提供的自動優化模型功能(Optimize)，比較內部交叉驗證均方差(RMSECV)、外部驗證均方差(RMSEP)和決定系數的大小，自動進行光譜范圍及預處理方法的選擇;由NIR光譜(見圖1)可知，在5 400～6 800 cm－1范圍內光譜吸收度的變化與樣品濃度的變化呈對應關系;避開淀粉和硬脂酸鎂(8 100～9 000 cm－1和4 500～5 500 cm－1)、水分(7 450～7 100 cm－1和5 600～5 100 cm－1)及部分輔料如滑石粉(在 7 200 cm－1附近有尖峰)的干擾［4］，最終選擇 2個較好的校正模型列于表1;由于模型1的內部交叉驗證均方差(RMSECV)、外部驗證均方差(RMSEP)為最小，且決定系數最接近100，因此，綜上所述，認為光譜的預處理方法為矢量歸一化、建模譜段為6 402.9～5 596.8 cm－1的校正模型1為最理想的模型。

4.2 近紅外模型的驗證

4.2.1 線性關系考察 在0.713 3%～2.188 0%的純度范圍內，以NIR預測值(Y)和HPLC測定值(X)求得線性方程為:Y=0.983 2X+0.026 7，r=0.991 6。其內部驗證相關性見圖3。

4.2.2 模型的可靠性和準確性 用模型1對驗證集中16個樣品的鹽酸小檗堿的含量進行預測，以考察模型的可靠性和準確性。外部驗證均方差(RMSEP)為0.127，決定系數為92.41。預測結果見表2，以NIR預測值與HPLC測定值的比值計算回收率，平均回收率為100.7%，RSD為5.63%(n=16)。

表1 三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定校正模型Tab.1 The calibration model for determination of the contents of berberine hydrochloride of Sanhuang Tablets

圖3 三黃片HPLC測定結果與NIR自我訓練測試結果相關性圖Fig.3 The HPLC(abscissa)and NIR calibration(ordinate)relativity grape of the contents(%)of Sanhuang Tablets

表2中NIR預測結果與HPLC測定值之間所建立的回歸方程為 Y=1.001 3X +0.010 7，r=0.967 3。因此可以認為該模型1可靠。NIR預測值與HPLC測定值對應關系見圖4。

4.2.3 重復性 選取建模樣品中其中一批樣品，隨機取6片，按前述測定方法掃描NIR圖譜，每片掃1次，取6次的平均圖譜，重復10次，并利用所建模型測其鹽酸小檗堿的含量，測定結果的RSD為1.8%，可見該方法的重復性良好。

表2 模型對驗證集三黃片的預測結果Tab.2 The prediction results of validation sample

圖4 三黃片HPLC測定結果與NIR外部驗證測試結果相關性圖Fig.4 HPLC(abscissa)and NIR prediction(ordinate)relativity grape of the contents of Sanhuang Tablets

4.3 在快檢工作中的實際應用

4.3.1 通用性模型具有涵蓋面廣，代表性強等優點，作者曾經對其建立過通用性模型，但是準確性較差，本實驗是根據轄區藥品質量狀況針對9家生產企業生產的藥品所建立的具有地方特色的專屬性模型，其針對性強，準確性較高，在藥品檢測車的實際應用中起到了一定的初篩效果。

4.3.2 在實際檢測操作中應注意，一是判斷每批樣品結果時，將平均光譜與6張光譜的測得值綜合起來判斷，其初篩的效果會更好;二是在磨片除去糖衣時，應按正反時針反復操作，以被磨處的表面平整、光滑、不殘留糖衣為佳。

5 結論

本實驗采用偏最小二乘法(PLS)，針對幾家特定的藥品生產企業生產的藥品，建立了三黃片專屬性近紅外定量分析模型，該方法快速、簡便，具有一定的專屬性，可用于藥品檢測車的現場快速分析，以提高抽驗不合格藥品的靶向命中率，充分發揮近紅外儀在藥品監督抽驗中的作用。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:328.

［2］國家食品藥品監督管理局稽查局.藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編(2003～2008年)［S］.2009:145-146.

［3］陸婉珍主編.現代近紅外光譜分析技術［M］.第2版.北京:中國石化出版社，2006.

［4］劉緒平，馮艷春，胡昌勤，等.頭孢拉定膠囊劑通用性近紅外定量分析模型的建立［J］.藥物分析雜志，2008，28(5):724.