酒當歸飲片質量標準研究

華永麗， 郭延生， 楊洪申， 杜天璽， 楊小虎， 秦 亮， 曲亞玲， 魏彥明

(甘肅農業大學動物醫學院，甘肅蘭州730070)

當歸為傘形科當歸屬植物當歸(Angelica sinensis(Oliv)Diels)的干燥根。當歸性溫，味甘辛，具有補血活血，調經止痛，潤腸通便的作用［1］。當歸主產于甘肅，長期以來，在臨床實踐中采用不同的炮制方法，使其發揮不同的臨床療效。研究表明當歸通過酒炒后，揮發油的顏色變深，折光率增大，有效成分在水中的溶解度增大，活血通絡的作用增強［2］，具有活血散瘀的作用［3］。臨床常用于血瘀、經閉、痛經、產后瘀滯腹痛、跌打損傷及風濕痹痛，經絡不利等癥。對酒當歸進行全面質量控制，是保證臨床用藥安全、有效的必要手段，但酒當歸中大多數化學成分無法進行準確定量。因此，本研究在酒當歸傳統鑒別的基礎之上，探討一種針對復雜系統，多組分化學物質的定量方法，以提高酒當歸質量控制水平。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 顯微鏡、自動薄層制板器、KQ-360DE型數控超聲波清洗器、玻璃儀器烘干器、TDI5-WS多管架自動平衡機、電子天平(型號AL104)、美國Agilent 1100型高效液相色譜儀、克羅瑪-薄層觀察分析儀(254 nm，365 nm)、稱量瓶、坩堝、微孔濾膜、移液槍、電熱恒溫鼓風干燥箱、SX-4-10智能纖維素電阻爐、循環水式多用真空泵(型號SHB—111)。

1.2 實驗藥品 水合氯醛、稀甘油、乙醚、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、1%碳酸氫鈉、甲醇、硅膠G薄層、正己烷、苯、2%碳酸鈉等，所用試劑均為分析純。當歸對照藥材(批號120927-200613中國藥品生物制品檢定所)、阿魏酸對照品(批號0773-9910中國藥品生物制品檢定所)。含量測定所用試劑均為色譜純。

1.3 酒當歸 取不同產地當歸飲片，用定量黃酒拌勻，悶透，酒被吸盡后，放炒制容器內，用文火加熱，炒干至深黃色，取出晾涼［3-4］。見表1。

表1 甘肅省14個不同產地的酒當歸樣品Tab.1 Origins of Angelica sinensis(oliv.)Diels and sample code of processed with wine

2 方法與結果

2.1 飲片性狀研究

2.1.1 酒當歸 當歸頭切片有大有小。最大的長為2.7 cm，寬為1.6 cm，厚為0.2 cm，最小的長為1.1 cm，寬為0.9 cm，厚為0.2 cm。表面顏色呈黃棕褐色，具有縱皺紋，斷面形成層為黃棕色，木質層顏色較淺。還混有粗細長短不一的歸耳，歸尾其表面層為棕褐色，但較炮制前較深。根頭部斷面層有空腔和髓。有濃郁的香氣和淡淡的酒味，味甘，辛溫，見圖1。

圖1 酒當歸飲片Fig.1 Parching Angelica with wine

2.1.2 生當歸 當歸頭的切片有大有小，較大的長為3.3 cm，寬為1.8 cm，厚為0.4 cm，較小的長為1.4 cm，寬為1.1 cm，厚為0.3 cm。表面顏色呈棕褐色，斷面形成層顏色為棕黃色，呈環狀，木質層顏色較淺，還有粗細長短不一的歸耳，歸尾。其表面層均呈顯棕褐色，根頭部斷面有空腔。氣味濃郁，味，甘，辛，味苦，見圖2。

圖2 生當歸飲片Fig.2 Unprocessed

2.2 飲片鑒別研究

2.2.1 粉末顯微鑒別 酒當歸:粉末顏色為淡黃棕色;導管顏色較深，其中梯紋網紋導管多見;木栓細胞中間帶為棕黃色;可觀察到油室及碎片，但比較少;薄壁細胞呈紡錘形，其中間帶為黃棕色。見圖3。

圖3 酒當歸粉末顯微Fig.3 Powder microphotograph of wine-baked Angelica

2.2.2 薄層色譜鑒別

2.2.2.1 當歸對照藥材薄層色譜鑒別 取酒當歸粉末0.5 g，加乙醚10 mL，超聲處理10 min，濾過，取濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取生當歸對照品粉末0.5 g，依供試品同法操作，即為對照品溶液;吸取上述15種溶液各5 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以正己烷—乙酸(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點。見圖4。

圖4 酒當歸與生當歸對照藥材比較薄層圖Fig.4 TLC of wine-baked Angelica and the comparison with control medicinal material of unprocessed Angelica

2.2.2.2 阿魏酸薄層色譜鑒別 取14個產地酒當歸粉末各3 g，加1%碳酸氫鈉50 mL，超聲處理10 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調至pH值2～3，用乙醚震蕩萃取2次，每次20 mL。合并乙醚液蒸干，殘渣加甲醇1 mL，使溶解作為供試品溶液。吸取上述14種溶液各10 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上;另吸取10 μL阿魏酸點于同一塊硅膠G薄層板上作為對照樣品。以正苯—乙酸乙酯—甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點。見圖5。

圖5 酒當歸與阿魏酸對照品比較薄層色譜圖Fig.5 TLC of wine-baked Angelica and the comparison with ferulic acid

2.3 檢查 按《中國藥典》2005年版一部(附錄)，分別測定當歸樣品中的水分，總灰分，酸不溶性灰分，浸出物測定法項下醇溶性浸出物測定法熱浸法測定，結果見表2。

表2 14個產地酒當歸樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物的百分含量Tab.2 The contents of water，total ash，extract in 14 different origins wine-baked Angelica

2.4 基于酒當歸的指紋圖譜的樣品含量測定

2.4.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB2C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)分析柱;流動相:1% 乙酸水(A相)∶乙腈(B相);梯度洗脫條件:B，0～10 min(20%～30%);10～20 min(30%～49%);20～40 min(49%);40～50 min(49% ～100%);50～60 min(100% ～20%)。流速:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:280 nm。

2.4.2 阿魏酸對照品溶液制備 精密稱取阿魏酸對照品1.5 mg，加甲醇至25 mL量瓶中，得60 μg/mL溶液，再取2 mL的溶液至25 mL的量瓶中，得4.8 μg/mL的阿魏酸對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液制備 精密稱取當歸粉末(40目)0.5 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 mL加入三角瓶中，密封，稱重，超聲提取60 min，放置至室溫，稱重，補足失重，0.45 μm濾膜過濾。取續濾液進樣10 μL。

2.4.4 參照峰的選擇 由于阿魏酸是當歸中的主要有效成分，且2005年版《中國藥典》規定其為評價當歸質量的指標性成分，選擇阿魏酸色譜峰作為參照峰，計算各共有峰的相對含量。

2.4.5 方法學考察

2.4.5.1 精密度 取同一份當歸樣品(j-4)的供試液，重復進樣5次，計算得各主要色譜峰的相對保留時間RSD為0.03% ～0.14%，峰面積比值RSD為0.54% ～2.06%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.4.5.2 穩定性 取同一份當歸樣品(j-4)的供試液，分別于0、3、6、9、12 和 15 h 檢測，計算各主要色譜峰的相對保留時間RSD為0.03% ～0.12%，峰面積比值RSD為0.29%～2.66%，表明供試液在15 h內基本穩定。

2.4.5.3 重復性 取酒當歸飲片樣品(j-4)6份，分別精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備供試液，再分別按上述液相色譜條件測定，計算各主要色譜峰的相對保留時間RSD為0.28% ～0.46%，峰面積比值RSD為0.75% ～1.82%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.4.5.4 線性關系的考察 精密吸取濃度為4.8 μg/mL 的阿魏酸對照品溶液 2、6、10、14、18 μL，注入液相色譜儀，按2.4.1項色譜條件分析，測定各自峰面積，以對照品濃度為橫坐標，峰面積值為縱坐標，求得回歸方程:Y=82.012X－41.053，r=0.999 8。結果表明阿魏酸在0.096～0.864 μg范圍內線性良好。

2.4.5.5 回收率試驗 取已知含量樣品0.5 g，共5份。置具塞三角瓶中，精密加入阿魏酸對照品適量，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液 25 mL，按2.4.3項下自“加入三角瓶中”起制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液及對照品溶液10 μL進樣，測定峰而積。外標一點法計算含量。5次測定的回收率平均為(97.9±1.4)%。

2.4.5.6 當歸樣品中指紋峰的定量 按上述液相色譜條件測定了自14個不同產地的14份酒當歸樣品3份平行樣品，根據各樣品圖譜中色譜峰的相對保留時間和阿魏酸對照品的相對保留時間，鑒定11個指紋峰，見圖6、7。峰1為阿魏酸，將指紋峰的紫外光譜與文獻［5-8］比較，推測峰2-11依次為洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、未知、阿魏酸松柏酯、洋川芎內酯A、丁基酜內酯，E-藁本內酯、Z-藁本內酯、Z-丁烯基酞內酯、levistolide A.。對這些指紋峰含量以基準峰阿魏酸為依據，計算每個指紋峰的相對含量，結果見表3。并計算其不同產地酒當歸及生當歸樣品11個指紋峰面積歸一法百分含量及其在總峰面積所占比例，結果見表4。由表4可以看出，其指紋峰峰面積所占比例在58% ～70%之間，能夠反映酒當歸樣品化學成分的基本情況。

圖6 14個不同產地酒當歸飲片HPLC指紋圖Fig.6 HPLC chromatograms of winebaked Angelica in 14 different origins

圖7 生當歸飲片HPLC指紋圖Fig.7 HPLC chromatograms of unprocessed Angelica

表3 14批酒當歸樣品指紋峰以阿魏酸計相對含量測定結果(±s)(mg/g)Tab.3 The relative peak aear of characteristic peaks in 14 different wine-baked Angelica(±s)(mg/g)

表3 14批酒當歸樣品指紋峰以阿魏酸計相對含量測定結果(±s)(mg/g)Tab.3 The relative peak aear of characteristic peaks in 14 different wine-baked Angelica(±s)(mg/g)

注:計算方法:以基準峰計指紋峰含量=(指紋峰峰面積/基準峰峰面積)×基準峰含量;1為阿魏酸基準峰。

樣品 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0±0.19 0.19±0.00 0.34±0.01 13.52 j-2 0.40±0.01 0.61±0.02 0.14±0.01 0.09±0.00 1.17±0.04 0.36±0.01 0.11±0.01 0.83±0.05 9.67±0.50 0.14±0.01 2.43±0.02 15.95 j-3 0.40±0.02 0.53±0.04 0.11±0.00 0.08±0.00 0.93±0.07 0.40±0.02 0.11±0.01 0.65±0.05 8.89±0.34 0.12±0.00 2.56±0.03 14.80 j-4 0.43±0.00 0.88±0.01 0.26±0.00 0.12±0.01 0.66±0.01 0.31±0.00 0.41±0.01 0.57±0.00 8.06±0.23 0.17±0.01 1.19±0.09 13.08 j-5 0.40±0.02 0.68±0.00 0.20±0.02 0.08±0.00 0.68±0.00 0.29±0.00 0.26±0.00 0.49±0.01 7.75±0.21 0.14±0.00 1.05±0.02 12.01 j-6 0.45±0.01 0.64±0.04 0.19±0.01 0.09±0.01 1.13±0.05 0.19±0.01 0.13±0.01 0.76±0.01 8.68±0.26 0.14±0.00 1.04±0.02 13.44 j-7 0.47±0.01 0.43±0.01 0.12±0.01 0.07±0.02 1.38±0.04 0.32±0.00 0.08±0.00 0.63±0.01 7.37±0.09 0.11±0.00 0.97±0.01 11.96 j-8 0.55±0.01 0.82±0.02 0.21±0.00 0.09±0.09 1.29±0.02 0.21±0.01 0.09±0.00 1.01±0.01 12.25±0.07 0.16±0.00 1.05±0.01 17.75 j-9 0.56±0.04 0.64±0.02 0.18±0.00 0.08±0.00 0.75±0.01 0.23±0.01 0.08±0.00 0.72±0.05 10.00±0.35 0.13±0.00 1.02±0.01 14.39 j-10 0.50±0.01 0.65±0.03 0.19±0.00 0.11±0.00 1.32±0.00 0.33±0.01 0.10±0.00 0.77±0.02 9.85±0.24 0.14±0.00 1.00±0.02 14.97 j-11 0.47±0.01 0.48±0.01 0.13±0.00 0.10±0.00 1.32±0.05 0.17±0.00 0.08±0.00 0.68±0.03 7.24±0.24 0.13±0.00 0.97±0.02 11.77 j-12 0.47±0.01 0.63±0.02 0.18±0.01 0.09±0.00 0.95±0.02 0.15±0.01 0.12±0.00 0.68±0.01 7.40±0.15 0.13±0.00 1.03±0.02 11.82 j-13 0.37±0.01 0.69±0.01 0.15±0.00 0.10±0.00 1.03±0.01 0.16±0.00 0.19±0.01 0.65±0.01 8.29±0.10 0.16±0.00 1.02±0.00 12.81 j-14 0.60±0.02 0.69±0.01 0.17±0.00 0.11±0.00 0.73±0.03 0.18±0.01 0.12±0.00 0.36±0.00 8.31±0.06 0.18±0.00 0.34±0.01 11.79 s-1 0.29±0.04 1.00±0.06 0.25±0.00 0.20±0.00 0.84±0.06 0.35±0.04 0.36±0.01 0.73±0.03 10.71±0.35 0.17±0.01 0.09±0.00 14.97 s-2 0.24±0.00 0.54±0.03 0.12±0.01 0.06±0.01 1.26±0.04 0.55±0.03 0.12±0.01 0.75±0.02 9.8總量j-1 0.49±0.01 1.15±0.01 0.33±0.01 0.14±0.01 0.66±0.03 0.14±0.00 0.29±0.00 0.67±0.01 9.1 6±0.23 0.13±0.01 0.13±0.00 13.76

表4 酒當歸及生當歸樣品指紋峰面積歸一百分含量/%Tab.4 Percent content of characteristic peaks in different wine-baked Angelica and unprocessed Angelica by peak area normalization method/%

2.4.5.7 生當歸與酒當歸指紋圖譜相似度分析

酒當歸14份樣品和生當歸2份樣品按上述方法導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004 A)，酒當歸與其對照譜的相似度為0.960±0.12(n=14)，生當歸與其對照譜的相似度為0.990±0.02(n=2)，而酒當歸與生當歸的相似度為0.919，可以看出，酒當歸樣品與生當歸存在差異，但差異較小。由圖6，圖7可知，11個指紋峰在14批樣品的色譜圖中均出現，各批供試品指紋圖譜的重現性較好，但各批供試品間共有指紋峰的相對含量有一定差別，其中9號峰即藳本內酯相對含量最高，為最主要特征成分，相比較生當歸其9號峰峰面積明顯增加。且酒當歸中檢出峰數也有所增加。

3 討論

3.1 采用中藥飲片研究方法，對產于甘肅岷縣、渭源、宕昌等道地產區的14批生當歸炮制后的酒當歸樣品進行測定比較，通過對酒當歸飲片的“性狀鑒別”、“理化鑒別”、“檢查”、“含量測定”等項目的系統研究。對各組研究數據資料進行系統分析，以此為基礎可以制定酒當歸飲片的名稱、藥材來源、飲片規格、顯微鑒別、水分限量、總灰分限量、酸不溶性灰分限量、浸出物限量、有效成分含量下限等飲片質量標準，能夠全面控制酒當歸飲片質量。

3.2 酒當歸飲片與生當歸飲片相比其表面顏色較深，有淡淡的酒香味，木質層顏色較深，這是傳統鑒別酒當歸的主要依據。粉末顯微鑒別試驗中生當歸和酒當歸的顯微結構發生了一定的變化如導管顏色加深，油室細胞被破壞從而減少，這是由于當歸在受熱和酒的作用下使得當歸的細胞結構遭到破壞而發生了變化［3］。以薄層色譜測定的結果來看，薄層色譜展開系統分離效果好，斑點清晰，稍有拖尾，供試品與生當歸對照品藥材色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。但實驗中發現，不同產地的酒當歸飲片斑點亮度不同，有些斑點不夠清晰，說明14個產地的酒當歸中成分含量有一定差異。

3.3 目前《中國藥典》中，以阿魏酸成分作為指標來控制當歸的質量或據此建立其質量標準，這不能很好的控制當歸炮制品的質量，也不能完全代表當歸的質量。長期以來中醫界對此頗有意見，不同意用某某素或某某苷來代表某某藥。中醫臨床用藥的整體觀點，它不僅是中醫藥幾千年來的傳統習慣，也是中醫藥區別于現代醫藥的重要方面之一［9］。采用的某一種或某幾種有效成分的含量來作為中藥質量評價標準的方法不夠充分、客觀，也難以為中醫藥理論所接受［10］。只要選擇一個能代表某味藥材的組分色譜峰，然后再選擇其他各味藥材代表峰，并對代表峰與標準峰比值作一限度范圍，即可對所要檢測中成藥中每味藥材做出一個較好的定性定量，以此來控制制劑的質量［11］。這在目前尚未弄清哪些有效成分之前，同時又缺乏相應的各種標準品之時，可保證中藥的質量，這種方法是可信可行的。本試驗針對酒當歸中化學成分復雜，其與生當歸化學成分相似，采用以阿魏酸單一對照品為基準對多指標成分定量分析方法，測定11個指紋峰的以阿魏酸計的相對含量，且對這11個峰所占比例進行分析，可以反映酒當歸化學成分的基本情況，這樣可以全面的控制酒當歸飲片的質量，提高酒當歸飲片質量控制水平，保證臨床安全、合理用藥。

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