響應(yīng)面分析法優(yōu)化胡蘆巴渣中黃色素提取工藝研究

李婉婷， 李穩(wěn)宏*， 唐 璇， 趙 鵬， 李學(xué)坤， 杜海勝

(1.西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710069;2.西安石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710065)

胡蘆巴為一年生豆科植物，具有營養(yǎng)、滋補(bǔ)的功效，一直以來被作為藥食同源之品［1，2］。胡蘆巴具有溫腎，祛寒，止痛等功效，胡蘆巴中的半乳甘露聚糖膠已被成功廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品、石油開采等行業(yè)［3］。近年來人工合成色素雖深受食品工業(yè)歡迎，但由于其對(duì)人體有影響與危害，因此人們?cè)絹碓街匾曁烊簧氐拈_發(fā)與應(yīng)用［4，5］。脫膠后的胡蘆巴渣顏色鮮黃，是一種提取天然黃色素的理想資源。本文重點(diǎn)對(duì)胡蘆巴黃色素提取工藝進(jìn)行了一定的探索，旨在為開發(fā)和利用該色素提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及儀器

材料及試劑:胡蘆巴渣;硅膠G，薄層層析用;乙醇等有機(jī)溶劑均為分析純。

試驗(yàn)儀器:雙波長紫外檢測(cè)器，2487型，美國Waters;721分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠;TG328A分析天平，湖南湘儀儀器廠;8302型電熱恒溫水浴，鞏義市英峪予華儀器廠;RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海嘉鵬科技公司。

2 分析方法與結(jié)果

2.1 胡蘆巴渣中黃色素分析檢測(cè)方法

用紫外－可見分光光度計(jì)對(duì)胡蘆巴色素的水溶液在波長范圍為200～700 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1。由圖可知，該色素存在兩個(gè)吸收峰分別為273 nm和336 nm，336 nm處于較為理想的分光光度計(jì)工作范圍內(nèi)，故選此波長處測(cè)定樣品的吸光度。

圖1 胡蘆巴色素的紫外-可見光光譜圖

2.2 樣品溶液中胡蘆巴黃色素的含量測(cè)定

2.2.1 胡蘆巴黃色素對(duì)照品的制備

將提取液的濃縮物經(jīng)反復(fù)柱層析純化精制作為色素對(duì)照品。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取精制得到的胡蘆巴黃色素100 mg置于100 mL量瓶，加蒸餾水定容后搖勻，配制成1 mg/mL的水溶液。分別精密吸取0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL 分別置 10 mL 量瓶，定容搖勻，在336 nm波長處測(cè)其吸光度。求得吸光度和濃度的回歸方程為A=3.527 2C+0.014 9，R2=0.999 9。結(jié)果表明在0.05～0.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，胡蘆巴黃色素提取液的吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.2.3 胡蘆巴色素濃度測(cè)定

將提取得到的胡蘆巴黃色素溶液量取5 mL，定容至50 mL，在336 nm處測(cè)定Abs值，根據(jù)濃度與吸光度的線性關(guān)系，可得到胡蘆巴黃色素濃度。

2.2.4 胡蘆巴色素的色價(jià)

精確稱取胡蘆巴黃色素1.000 g，用90%乙醇定容至100 mL，配成1%的色素乙醇溶液，在336 nm下用1 cm比色皿，測(cè)定樣品的吸光度，按下列公式計(jì)算求得色價(jià):

式中 E—表示在1 cm比色皿，在相應(yīng)λmax處溶液濃度為1%時(shí)的色價(jià);A—在λmax處的吸光度值;V—溶液的體積(mL);m—樣品重量，g。

2.2.5 提取溶劑的選擇

稱取脫脂胡蘆巴渣5 g，在溫度65℃、液料比8∶1 mL/g的條件下，分別用無水乙醇、氯仿等溶劑提取2 h，將各提取液取5 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同提取溶劑的對(duì)比

由表1可知，胡蘆巴黃色素難溶或不溶于非極性溶劑，易溶于無水乙醇，故后續(xù)試驗(yàn)均采用乙醇為提取溶劑。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度的影響

分別稱取5 g脫脂胡蘆巴渣原料5份，在溫度65℃、液料比為8∶1 mL/g的條件下，提取2 h，將各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，考察乙醇濃度對(duì)提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖可知，90%的乙醇溶液提取效果最為理想。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取過程的影響

2.3.2 提取時(shí)間的影響

分別稱取5 g脫脂胡蘆巴渣原料5份，以90%乙醇為提取溶劑，在液料比8∶1 mL/g、溫度65℃的條件下提取不同時(shí)間，將各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，考察提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取過程的影響

由圖3可知，提取液的吸光度隨提取時(shí)間的增加而增大，但當(dāng)提取時(shí)間超過2 h時(shí)，其吸光度值變化趨于平緩。

2.3.3 料液比的影響

分別稱取5 g脫脂胡蘆巴渣原料5份，以90%乙醇為提取溶劑，分別以不同的液料比在65℃下提取2 h。將各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)液料比大于10∶1 mL/g時(shí)，提取液吸光度變化緩慢，所以液料比10∶1左右為宜。

圖4 液料比對(duì)提取過程的影響

2.3.4 提取溫度的影響

分別稱取5 g脫脂胡蘆巴渣原料5份，以90%乙醇為提取溶劑，在液料比10∶1 mL/g，提取2 h，將各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，考察提取溫度的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。

由圖5可知溫度70℃左右時(shí)提取效果最好，超過70℃時(shí)吸光度反而降低，可能是因?yàn)闇囟冗^高對(duì)色素會(huì)有一定的破壞所致。

2.3.5 提取次數(shù)的影響

分別稱取5 g脫脂胡蘆巴渣原料5份，以90%乙醇為溶劑，在液料比10∶1 mL/g，70℃下提取2 h，將各提取液取1 mL定容至50 mL，在336 nm下測(cè)定其Abs值，研究提取次數(shù)對(duì)提取的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 提取次數(shù)對(duì)提取過程的影響

由圖6可知:提取超過2次后其對(duì)提取液吸光度明顯減小，從經(jīng)濟(jì)方面考慮提取3次即可。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù) Box－Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［6］，綜合單因素實(shí)驗(yàn)影響結(jié)果對(duì)比分析可知，提取溫度、時(shí)間、液料比對(duì)胡蘆巴色素提取效果影響較為顯著，故以該三因素設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素水平表

經(jīng)過RSM軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)回歸分析，響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表4可知，模型的顯著性F值=50.03＞0.05，顯著性水平P值＜0.000 1，表明該模型是顯著的，即試驗(yàn)是可靠的。分析結(jié)果方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)都是顯著的，因此，說明各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。結(jié)果作用顯著的是由此還可以看出交互項(xiàng)交互影響不顯著，即表明溫度、提取時(shí)間、料液比之間交互作用不顯著。

表3 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)值

表4 方差分析

利用design expert軟件對(duì)二次回歸方程的響應(yīng)面圖分別見圖7、圖8和圖9。

圖7 液料比與溫度交互作用對(duì)提取的影響

由上圖可知，提取因素影響的大小依次為提取溫度、提取時(shí)間和液料比，其中提取溫度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較為陡峭。

經(jīng)軟件對(duì)各因素回歸擬合后，得到回歸方程:Y=0.49+0.048x1+0.028x2+0.011x3－0.005 225x1x2－0.001x1x3+

圖8 提取時(shí)間與溫度交互作用對(duì)提取的影響

圖9 液料比與提取時(shí)間交互作用對(duì)提取的影響

根據(jù)所得到的模型，可預(yù)測(cè)在穩(wěn)定狀態(tài)下的最大響應(yīng)值為Y=0.508，對(duì)響應(yīng)面結(jié)果利用軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，以黃色素Abs值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到相應(yīng)的提取工藝優(yōu)化條件為:溫度73.3℃，試驗(yàn)時(shí)間2.3 h，液料比10.4∶1 mL/g。

為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行胡蘆巴渣黃色素的提取試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為提取溫度70℃，試驗(yàn)時(shí)間2.3 h，液料比10∶1 mL/g，提取3次;共進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表中數(shù)據(jù)可知，在優(yōu)化條件下提取液中黃色素的平均吸光度值與理論預(yù)測(cè)值吻合程度良好。

表5 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

3.1 得到了一條從胡蘆巴渣中提取黃色素的工藝路線。在溶劑篩選以及單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到了該工藝路線優(yōu)化的工藝操作參數(shù):乙醇濃度90%，提取溫度70℃，提取時(shí)間2.3 h，液料比10∶1 mL/g，提取次數(shù)3次，色素色價(jià)為32.43。

3.2 胡蘆巴黃色素溶液在273 nm和336 nm處有較為強(qiáng)烈的吸收峰，多數(shù)的黃酮類化合物由兩個(gè)主要吸收帶組成，帶I在300～400區(qū)間，帶II在240～285區(qū)間，因此可初步推斷胡蘆巴黃色素為黃酮類色素。

3.3 研究結(jié)果不但可提高廢棄脫膠胡蘆巴渣的資源化綜合利用價(jià)值;同時(shí)可提供一條新的天然黃色素途徑。

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