黃連解毒湯全方與“組合-配伍”提取的比較研究

朱華旭， 潘林梅， 李 歡， 唐于平

(1.南京中醫藥大學中藥復方分離工程重點實驗室江蘇省方劑研究重點實驗室，江蘇南京210029)

中藥(含復方，下同)由植物、動物和礦物等天然產物構成，其藥效物質的獲取，不可避免的需要“去偽存真，去粗取精”，因而“分離”是中醫藥領域的共性關鍵技術［1］。中藥提取分離也是中成藥生產過程中最關鍵的環節，制藥工藝、技術的不同能引起成分組合的變化，成分組合的變化可以導致藥效的顯著變化，它直接影響到產品的質量和臨床療效［2］。

黃連解毒湯源于《外臺秘要》，由黃連、黃柏、黃芩、梔子組成，具有清熱、瀉火、解毒的功效［3］。黃連解毒湯的傳統服用方法是湯劑入藥。上世紀90年代，日本學者在應用黃連解毒湯治療腦中風的研究中發現，黃連解毒湯提取物用于腦中風后遺癥和腦血管性癡呆癥，其效優于苯噻嗪酸鈣而無任何副作用;該提取物(エキス)是一種日本漢方制劑，制備方法是利用現代生產技術，模擬傳統的中藥煎煮方法，將中藥的煎取成分制成固體劑型;這一成果得到日本醫學界的確認［4］。近年來，我國學者對其改善腦缺血、益智作用的有效部位進行了探索性的研究，研究表明，該方治療腦部疾病的有效部位為復方中的水溶性成分，包括小檗堿、黃芩苷和梔子苷等［5］。基于上述研究成果，本論文對全方水提取最優工藝進行探討，并對君臣藥組合、君佐藥組合、君使藥組合、君臣佐藥組合、君佐使藥組合水提取工藝中指標性成分進行檢測，旨在通過闡明復方配伍對君藥中指標性成分的影響，建立可體現該方治療特點的工業化生產工藝，為該方的新藥創制提供實驗依據。

1 儀器與材料

Agilent 1100液相色譜(Agilent 1100四元泵;DAD檢測器;自動進樣器;Agilent 1100 LC色譜工作站)，江蘇漢邦科技有限公司生產Kromasil C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，Shimadzu Libror AEL－40SM電子天平。

藥材均購自南京市藥材公司，經本校生藥教研室王春根教授鑒定。黃連、黃芩、黃柏、梔子批號分別為050926、051015、050926、041106。對照品均購自中國藥品與生物制品檢定所，小檗堿批號為110713－200208(供含量測定用)，巴馬汀批號為0732－200005(供含量測定用)，藥根堿批號為0733－200005(供含量測定用)，黃芩苷批號為 110715－200212(供含量測定用)，梔子苷批號為110749－200511(供含量測定用)。乙腈、甲醇均為色譜純(江蘇漢邦公司)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 黃連解毒湯全方水提取工藝的研究

黃連、黃柏、黃芩、梔子全方藥材按6∶4∶4∶6比例取9份，每份200 g，采用L9(34)正交試驗法，分別以加水量(12倍、15 倍、18 倍)、提取時間(2 h、3 h、4 h)、提取次數(1 次、2次、3次)為正交因素，確定復方最佳水提工藝條件。測定各指標性成分生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿)、黃酮苷、梔子苷的轉移率，確定全方提取物中各指標性成分的含量。

2.2 黃連解毒湯組方－配伍水提取工藝的研究

根據數學組合原理，君藥黃連與臣、佐、使三味藥組成5個組合，分別為:黃連+黃芩(君臣藥組合)、黃連+黃柏(君佐藥組合)、黃連+梔子(君使藥組合)、黃連+黃柏+黃芩(君臣佐藥組合)、黃連+黃柏+梔子(君佐使藥組合)，藥材按原方比例取樣200 g，以全方的最佳水煎煮工藝提取各組藥物組合，測定各指標性成分生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿)和黃酮苷或梔子苷的轉移率，比較不同組合中各指標性成分的含量。

2.3 各指標性成分的檢測方法

采用HPLC色譜法檢測各指標性成分的含量。色譜條件:柱溫30℃;流速1.0 mL/min;檢測波長238 nm、265 nm、280 nm;流動相為梯度洗脫［6］，A相為乙腈，B相為0.5%三乙胺(磷酸調pH3.1)，梯度為0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50 min 20%A ～30%A，50～55 min 30%A～5%A。色譜圖見圖1～3。

圖1 生物堿HPLC圖譜

圖2 梔子苷HPLC圖譜

圖3 黃芩苷HPLC圖譜

2.4 樣品溶液的制備

取各組號煎煮液100 mL，干燥至衡重，測定固含量。取各組上述已測定固含的干燥物各0.1 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加35 mL的50%ACN，超聲30 min(功率250 W，頻率50 Hz)，放冷至室溫，加50%ACN定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得［7］。

2.5 藥材樣品制備與含量測定

按照2005年版《中國藥典》進行樣品制備與含量測定［8］。

3 結果

3.1 黃連解毒湯全方水提取最佳工藝

采用L9(34)正交試驗法，進行了9次試驗，見表1。以生物堿(小檗堿、巴馬汀、藥根堿三者之和的平均值)、黃酮苷、梔子苷轉移率進行考察，確定提取的最佳工藝。

表1 正交設計表

按照2.4項法制備正交實驗所對應的各樣品溶液1～9，按照2.3項檢測樣品1～9中上述5種指標性成分的含量，計算各成分相對藥材的轉移率，結果見表2、3。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

由表3的方差分析表可以看出，三因素對水煎煮工藝均無顯著性影響;由表2的簡單計算可以看出，K3a＞K2a＞K1a，故因素A選擇水平3，即加18倍量;K3b＞K2b＞K1b，且K2b與K1b差值遠大于K3b與K2b差值，原則上可選擇水平2～3之間的任一點，但從節約能源的角度考慮，因素B選擇水平2，即煎煮3 h;K2c＞K3c＞K1c，故因素C選擇水平2，即煎煮兩次。綜上所述，確定黃連解毒湯全方水煎煮的最佳提取工藝為A3B2C2，即加18倍量水煎煮2次，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。

3.2 黃連解毒湯全方水提取最佳工藝驗證

黃連、黃柏、黃芩、梔子全方藥材按6∶4∶4∶6比例取3份，每份200 g，按照上述最優工藝條件提取，提取液分別測定平均轉移率。見表4。

表4 最佳工藝條件驗證

由表4可知，按正交試驗優選的最佳工藝進行試驗，平均轉移率大于50%，有效成分提取較完全。

3.3 黃連解毒湯組方－配伍水提取工藝

組方－配伍五組為黃連 +黃芩、黃連 +黃柏、黃連 +梔子、黃連+黃柏+黃芩、黃連+黃柏+梔子，以黃芩+梔子、全方兩組為對照，分別以18倍量水煎煮提取各組藥物組合，第1次10倍量水、第2次8倍量水，每次1.5 h。煎煮后各樣品按照2.4項法制備樣品溶液1′～7′，按照2.3項檢測樣品1′～7′中上述5種指標性成分的含量，計算各成分相對藥材的轉移率，結果見表5。

表5 組方-配伍試驗結果(n=3)

4 討論

4.1 由于黃連解毒湯各藥配伍的復雜性和不穩定性，在傳統煎煮過程中，黃連中的季銨堿與黃芩中的黃芩苷發生反應而產生大量沉淀;藥味不同配伍煎煮對黃連中小檗堿的溶出率亦有顯著性影響，黃連與黃柏配伍，生物堿含量增高，但其溶出率不等于兩藥材中小檗堿含量的簡單加和;黃連與黃芩、黃連與梔子配伍，小檗堿溶出率均較單味黃連水煎液降低;全方煎煮時，小檗堿溶出率則是各味藥材協同作用的結果［3］。因此在全方及不同組合的水溶液環境中各指標性成分的含量和相互影響的研究基礎上，通過建立全方及不同組合中各指標性成分體外濃度與體內吸收、分布的相關性，對于闡明復方量效關系的具有實質性意義。

4.2 本論文通過正交試驗確立了全方水煎煮的最佳工藝，以期在水煎煮工藝操作中，獲得穩定的、可再現的全方提取物，為后續的體內藥物動力學研究奠定了基礎。在確立水煎煮最佳工藝后，我們分別考察不同組合對黃連中生物堿轉移率的影響。研究發現，在復方水溶液體系中，梔子苷的含量基本保持穩定，生物堿轉移率受到黃芩苷的影響較大，但全方共煎的轉移率仍較黃連黃柏配伍組合高，因此，能否從化學成分的角度印證傳統湯劑組方的合理性，值得進一步商榷。

4.3 中藥間合理的配伍是中藥復方的核心，也是復方不同于單味藥的主要奧妙所在。古人說“藥有個性之特長，方有合群之妙用”。中藥復方多以湯劑入藥，傳統湯劑是在中醫藥理論指導下，按君臣佐使的組方原則配伍的有機組合，深入地對各藥味進行化學成分研究，探討藥味各組分在療效中所起的作用和組方配伍原則，進而闡明湯劑的物質基礎和作用機理，是創立和研制新方的重要依據。

［1］郭立瑋，潘林梅，朱華旭.中藥提取物伴生物質的生物藥劑學特性及其制劑學意義［J］. 中草藥，2007，38(9):1281－1286.

［2］曹春林主編.中藥藥劑學［M］.上海:上海科學技術出版社，1990:559－575.

［3］陳光亮，張秀榮，王欽茂.黃連解毒湯的化學及藥理學研究進展［J］. 中草藥，2008，39(6):935－938.

［4］李華安.黃連解毒湯的研究及應用［J］.山東中醫學院學報，1995，19(5):312.

［5］張藝平，韓 鵬.黃連解毒湯治療腦病的藥理與臨床研究新進展［J］. 中華實用中西醫雜志，2003，16(12):1832－1834.

［6］任玲玲，薛興亞.黃連解毒湯高效液相色譜分析方法的建立［J］. 世界科學技術－中醫藥現代化，2005，7(5):41－44.

［7］沈 嘉，趙建平.黃連解毒湯質量考察［J］.中成藥，1999，21(10):502－504.

［8］中國藥典［S］.2005:173，211－212，214－215.