不同采收期山里紅葉總黃酮及牡荊素-2″-O-鼠李糖苷含量研究

李云興， 柴紀嚴， 吳成舉， 英錫相*

(1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連116600;2.遼寧中醫藥大學教學實驗中心，遼寧沈陽110032)

山里紅葉(leaves of Crataegus pinnatifida Bge.var Major)被中國藥典(2005)版所收載［1］，用于活血化瘀，理氣通脈［2］。早在東晉《肘后方》中就有山里紅葉(山楂葉)“莖葉煮汁，洗漆瘡”的記載。一般文獻報道并未將其藥理作用區分。近年來，有大量的文獻報道:山里紅葉即山楂葉具有降壓、增加冠脈血流量、降血脂、強心等作用。但是，研究證明，不同采收期的山楂葉中總黃酮含量及單體有效成分的含量差異較大。由于山里紅葉在此方面研究少有報道，因此我們分別以山里紅葉總黃酮及主成分—牡荊素－2″－O－鼠李糖苷［3］為考察指標，采用紫外分光光度法與高效液相色譜法(HPLC)對其含量進行測定，最終通過研究結果分析，確定山里紅葉最佳采收期，科學合理的采收山楂葉。

1 總黃酮含量測定

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 3010紫外分光光度計(日本日立公司);AGBP210S電子天平(德國Satorius公司);AS3120A超聲提取器。

1.1.2 試藥與藥品 蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號080－9002);乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，以上試劑為分析試劑;不同采收期山里紅葉采收于遼陽(5月至10月，每周1次，共23次)。

1.2 方法與結果

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使之溶解，冷卻，加乙醇至刻度，搖勻，即得。(每1 mL中含無水蘆丁0.2 mg)。以蘆丁對照品溶液在紫外范圍內掃描吸收波長，測得最大吸收波長為509 nm，因此選擇此波長為總黃酮測定波長。

1.2.2 標準曲線的制備 精密稱取對照品溶液1，1.5，2，2.5，3 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉試液4 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，立即照紫外分光光度法在509 nm波長處測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程為:A=11.406C+0.014 8，r=0.999 5。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取山里紅葉0.1 g置于具塞錐形瓶中，加不同濃度乙醇適量，超聲濾過，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉試液4 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，即得。

1.2.4 超聲提取條件 正交法確定超聲提取工藝條件:采用超聲波提取主要是利用超聲波破碎作用(空化作用)和強化傳質(機械作用)，因此，影響超聲波提取的因素很多，如:溶劑的濃度、提取時間、溶劑量等，為了更好地比較各因素對山里紅葉提取的影響程度，并根據參考文獻的影響因素，選取了濃度、時間、溶劑量這3個因素，運用正交法確定超聲提取山里紅葉的優化條件。見表1。

表1 正交實驗因素及水平設計

1.2.5 超聲提取工藝考察 結果按表1選擇的研究因素及其水平進行實驗，實驗結果及數據處理見表2。由極差分析可知，各因素對提取率的影響的大小排序為:C(溶量)＞A(濃度)＞B(時間)，優化條件最佳組合為A2B3C1，即50%乙醇10 mL，超聲45 min。正交實驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗結果

表3 方差分析

1.2.6 不同采收期山里紅葉總黃酮含量測定 在超聲萃取的優化實驗條件下，分別提取了多個不同采收期山里紅葉樣品，在最大吸收波長509 nm處測定吸收值，分別計算山里紅葉中總黃酮含量。以含量(%)為縱坐標，以采收期(以周記)為橫坐標作圖，見圖1。

2 單體有效成分含量的研究

圖1 不同采收期山里紅葉總黃酮含量

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀四元泵 (美國安捷倫公司);AGBP210S電子天平(德國Satorius公司);AS3120A超聲提取器。

2.1.2 試藥與藥品 色譜純乙腈、四氫呋喃、甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)，其它試劑均為分析純;對照品牡荊素－2″－O－鼠李糖苷［5］(自制，采用高效液相峰面積歸一化法，純度＞98%)。不同采收期山里紅葉(5月至10月，每周1次，共23周)。

2.2 方法與結果

2.2.1 色譜條件 色譜柱:(Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm，5 μm)(迪馬公司，中國北京);流動相:采用二元梯度系統，溶劑A:乙腈－四氫呋喃(97∶3);溶劑B:1%磷酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表4;檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表4。

表4 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取不同采收期山里紅葉0.1 g置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，超聲45 min，過濾，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，備用。

2.2.3 對照品溶液的制備 取牡荊素－2″－O－鼠李糖苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻。最后配置的對照品濃度為1.33 mg/mL，備用。

2.2.4 超聲提取條件考察 精密稱取不同采收期山里紅葉(第17周采收樣品)，選取了時間、溶劑這2個因素，確定超聲提取山里紅葉的優化條件，結果見表5，6。

表5 超聲時間考察

2.2.5 標準曲線制備 精密量取對照品溶液適量分別置6個10 mL 量瓶中，其濃度分別為 4，10，25，50，100，400 μg/mL，以色譜峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為:A=5.890 4C－1.873 5，r=0.999 5。

表6 溶劑考察

2.2.6 精密度試驗 取山里紅藥材(第17周采收)6份，按供試品溶液的制備項下方法進樣操作，分別測定5次，結果見表7。

表7 精密度試驗結果

結果表明，儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取山里紅藥材(第17周采收)6份，分別按供試品溶液的制備項下方法測定，結果見表8。

結果表明，本方法的重復性較好。

2.2.8 穩定性試驗 將第17周采收藥材按供試品溶液的制備項下方法每隔2 h進樣1次，分別測定其色譜峰面積，結果見表9。

表8 重復性試驗結果

表9 穩定性試驗結果

結果表明，色譜峰面積在8 h內基本無變化，表明本實驗條件下穩定性良好。

2.2.9 回收率試驗 精密吸取已知牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量為11.14 mg/g的山里紅藥材粉末(過2號篩)6份，各0.05 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入牡荊素－2″－O－鼠李糖苷對照品溶液(1.33 mg/mL)0.4 mL，按供試品溶液制備方法操作，即得加樣回收溶液，精密吸取加樣回收溶液10 μL，注入液相色譜儀中，結果見表10。

表10 回收率試驗結果

結果表明，本方法回收率較高。

2.2.10 不同采收期山里紅葉單體有效成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量的測定［4］將制備完成的23份供試品溶液分別進樣，進樣量 10 μL，記錄峰面積，計算牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量，對照品及供試品高效液相色譜圖見圖2。以含量(%)為縱坐標，以采收期(周)為橫坐標作圖，見圖3。

圖2 對照品牡荊素-2″-O-鼠李糖苷(a)及山里紅葉(b)高效液相色圖

3 討論

通過本實驗對5～10月23周山里紅葉的考察研究，我們確定了紫外分光光度法測定山里紅葉的總黃酮含量的最佳工藝:50%乙醇10 mL，超聲45 min。以及高效液相色譜法測定單體有效成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量的最佳工藝:50%甲醇25 mL，超聲45 min。綜合考慮實驗結果及藥材采收量因素，可以看出7～9月采收的山里紅葉總黃酮含量及牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量較高，由此推斷7～9月為山里紅葉的最佳采收期。山里紅葉有著資源豐富，價格低廉，藥理作用顯著等優點，具有廣闊的發展前景。由于不同采收期的山里紅葉化學成分含量相差較大，因此本文以總黃酮及山里紅葉中主要成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷為考察指標，分別運用紫外可見分光光度法與高效液相色譜法，確定7～9月為山里紅葉最佳采收期，為科學合理的采收山里紅葉提供了科學依據。

圖3 不同采收期山里紅葉牡荊素-2″-O-鼠李糖苷含量

［1］中國藥典［S］.一部.2005:22.

［2］國家中醫藥管理局.中華本草［M］.上海:上海科學技術出版社，1999.

［3］Ying Xixiang，Lu Xiumei，Sun Xiaohong，et al.Determination of vitexin－2″－O－rhamnoside in rat plasma by ultra－performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry and its application to pharmacokinetic study［J］.Talanta，2007，72(4):1500－1506.

［4］崔延萍，崔樹玉.山楂葉中牡荊素鼠李糖苷含量測定［J］.中草藥，2000，31(12):906－907.