芍藥苷下調PC12細胞酸敏感離子通道1a的表達拮抗酸誘導的鈣內流

曹碧茵，孫 雪，楊亞萍，，孔 巖，劉春風，

(1.蘇州大學附屬第二醫院神經內科，江蘇蘇州 215004;2.蘇州大學神經科學研究所，江蘇蘇州 215123)

CAO Bi-yin1，SUN Xue1，YANG Ya-ping1，2，KONG Yan2，LIU Chun-feng1，2

(1.Dept of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou Jiangsu 215004，China;2.Institute of Neuroscience，Soochow University，Suzhou Jiangsu 215123，China)

酸敏感離子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是一類能被細胞外H+激活的陽離子通道，其中的ASIC1a亞基能介導鈣的內流，參與了腦缺血缺氧、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等神經系統疾病的病理過程［1］。阻斷ASIC1a的激活或降低其表達均可起到一定的神經保護作用［2］，為神經退行性疾病提供了一個新的防治策略。本研究在PC12細胞上觀察酸性培養液對細胞內游離鈣離子濃度、ASIC1a轉錄及表達的影響，并給予芍藥苷(Paeoniflorin，PF)進行干預，ASICs的非特異性阻斷劑阿米洛利(amiloride，Ami)作為陽性對照藥物，以探討PF對ASIC1a的表達是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 芍藥苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所;Amiloride、Fluo-3/Am購自Sigma公司;RPMI 1640培養基、新生牛血清購自Gibco公司;定量RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;兔抗ASIC1抗體購自Alpha Diagnostic International公司;小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體、ECL發光劑等均購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養及處理 PC12細胞用RPMI 1640完全培養基(含10%新生牛血清)進行常規培養。實驗前1 d接種于6孔培養板，穩定生長24 h，將細胞分為4組:正常對照組(control)更換為pH 7.2的新鮮培養基;酸處理組(pH 6.0)更換為pH 6.0的酸性培養基;Ami組和PF組則分別在酸性培養基內加入 Ami(100 μmol·L－1)或 PF(50 μmol·L－1)，繼續培養24 h。

1.3 流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化 收集細胞，預冷無鈣磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，調整細胞濃度為1×109·L－1。取 200 μl細胞懸液，加入終濃度為 10 μmol·L－1的 Fluo-3/Am，37℃ 孵育 30 min，漂洗后重懸于 200 μl PBS中，上流式細胞儀檢測，激發波長488 nm，每組取10 000個細胞的熒光強度值的平均值為每份標本的測定值。

1.4 定量RT-PCR檢測ASIC1a mRNA轉錄水平 提取細胞總RNA，按試劑盒說明書進行RT反應，得cDNA模板。根據目的基因在GenBank中的已知序列，由寶生物工程(大連)有限公司設計合成引物。ASIC1a引物:上游5′-GCCCACATCTTCTCCTAT-3′，下游 5′-CTTGGTGACGTGGTGATA-3′;β-actin 引物:上游 5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游 5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′。兩步法進行 PCR反應，同時測定各樣本的溶解曲線。每樣本做3個復管，求出各樣本平均 Ct(cycle threshold)值，再按2－△△Ct進行相對定量分析，求出各組細胞ASIC1a mRNA相對于正常對照組的Fold值。將上述過程重復3次，進行統計學分析。

1.5 Western blot檢測ASIC1a的蛋白表達 收集細胞，提取細胞總蛋白。經濃度測定及變性后，取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，將膠上蛋白轉移至PVDF膜，封閉后分別加入ASIC1(1∶1 000)和 β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜。次日TBST洗3次，加入HRP標記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL發光法顯影于X光膠片上。免疫印跡條帶密度=面積×灰度，每個樣本的條帶密度與同一樣本的β-actin進行比較求出比值，再計算出相對于正常對照組的Fold值。將整個實驗重復3次，進行統計學分析。

2 結果

2.1 各組細胞內游離鈣離子濃度的變化 pH 6.0組Fluo-3的平均熒光強度為4.55±0.45，高于 control組(2.44±0.03，P=0.015);與pH 6.0組相比，Ami組和PF組的熒光強度降低(3.15±0.38)s(P=0.003)、(3.01±0.18)s(P=0.002)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組細胞ASIC1a mRNA轉錄水平的變化 pH 6.0組ASIC1a mRNA的轉錄水平升高至control組的(3.36±1.30)倍，差異有統計學意義(P=0.035)。與pH 6.0組相比，Ami組和 PF組 ASIC1a mRNA轉錄水平均明顯降低(0.63±0.48)s(P=0.007)、(1.19±0.31)s(P=0.018)，但是control組、Ami組和PF組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3 各組細胞ASIC1a蛋白表達的改變 pH 6.0組ASIC1a的蛋白表達水平升高到control組的(1.29±0.11)倍，差異有統計學意義(P=0.047)。與pH 6.0組相比，Ami組和PF組ASIC1a的表達降低(0.58±0.16)s(P=0.004)、(0.70±0.23)s(P=0.010)，但是 control組、Ami組和 PF組之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

ASIC1a亞基在中樞神經系統廣泛表達，可直接或間接促進鈣離子內流，引起隨之發生的鈣超載和細胞凋亡［2］。ASICs與PD、HD等神經系統疾病的關系日益得到關注，阻斷ASIC1a的通道功能或利用基因敲除技術減少ASIC1a的蛋白表達均能起到治療作用［3，4］。尋找以ASICs為靶點的藥物，設計和改造具有高選擇性和高活性的ASICs抑制劑成為神經生物學和藥物化學的研究熱點之一。

PF是芍藥的主要活性成分，抑制炎癥反應［5，6］、減少鈣內流、清除活性氧［7］、拮抗神經細胞的受損死亡，在 PD［8］、腦缺血缺氧［9］、癲癇等多種病理模型中發揮了神經保護作用，而這些病理模型均表現出局部的組織酸化現象，并發現了ASICs的異常激活。因此，ASICs可能是PF發揮神經保護作用的潛在靶點。

本研究利用pH 6.0的酸性培養基特異性地激活ASIC1a亞基，導致PC12細胞內游離鈣離子升高，ASIC1a的表達水平明顯上調。PF不但降低了細胞內游離鈣離子濃度，還使ASIC1a的轉錄和表達均維持在正常狀態，其藥效與Ami相比沒有明顯差異，并且有效濃度低于Ami，因此PF有可能是ASIC1a的天然抑制劑。

(致謝:蘇州大學放射醫學與公共衛生學院、江蘇省放射醫學與防護重點實驗室為本研究提供了良好的科研條件和大力支持。)

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