雷諾嗪后處理對大鼠心肌再灌注損傷營救激酶及線粒體滲透性轉換孔道的影響

陳玉培，向許進，閔 蘇

我們在前期試驗中發現雷諾嗪后處理(ranolazine postconditioning，RpostC)能改善大鼠離體缺血/再灌注心肌心功能及冠脈流量，降低冠脈流出液中肌酸激酶(CK)與乳酸脫氫酶(LDH)的活性和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(CTnI)的含量，但其作用機制尚不清楚。研究證實［1］，缺血后處理的抗凋亡作用與其抑制線粒體通透性轉換孔道(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)開放和激活再灌注損傷營救激酶(reperfusion injurysalvage kinase，RISK)途徑有關。本研究通過觀察雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注心肌細胞凋亡、MPTP和RISK途徑的影響，初步探討雷諾嗪后處理心肌保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年SD大鼠，體重180～250 g，由重慶醫科大學動物中心提供。

1.2 主要儀器及試劑 離體心臟灌流系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)，Ultrospec 2100 pro紫外/可見分光光度儀(美國通用電器)，IMMULITE 2000化學發光免疫分析儀(天津德普診斷產品有限公司)，PowerPac HC電泳儀、GelDoc凝膠成像系統和quantity one分析軟件(美國 BIO-RAD)。雷諾嗪(ranolazine，092K4708，美國 Sigma 公司)，atractyloside(MPTP 開放劑，029H06461，美國 Sigma)，PD98059(ERK1/2抑制劑，24661-02S，美國 Biosource);wortmannin(Wort，PI3K 抑制劑，L15531，美國 Alexis Biochemicals)，p-P44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)(E10)小鼠單克隆抗體(#9106S，美國Cell Signaling Technology)，p-磷 酸 化-AKT(Ser473)(587F11)小鼠單克隆抗體(#4051S，美國Cell Signaling Technology)，GAPDH人單克隆抗體(bsh-0510M，北京博奧森生物技術有限公司)，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(ZB-2305，北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 Langendorff心臟灌注模型的建立 SD大鼠腹腔注射 20%烏拉坦 1.0 g·kg－1及肝素鈉1 000 U·kg－1，麻醉后無菌下開胸，快速取出心臟，立即置于預先用95%O2+5%CO2混合氣體(1.5 L·min－1)飽和的4℃ K-H 緩沖液［成分(mmol·L－1):NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5、NaHCO325.0、MgSO41.2、葡萄糖 11.1、EDTA-2Na 0.125］中漂洗并輕輕擠出心臟中的血液;用眼科鑷將主動脈置于Langendorff灌注管口，用絲線固定后行心臟逆行恒壓灌注(灌注壓為為100 cm H2O)。整個操作過程應在2 min內完成。K-H緩沖液的灌注壓為100 cmH2O、PO266.7 ～73.3 kPa、PCO24.8～5.6 kPa，pH值7.35～7.45。整個灌注系統及心臟周圍用恒溫水浴循環器維持在(37±0.5)℃，室溫控制在(25±1)℃。灌流開始數秒內心臟即可開始跳動。平衡20 min，心臟搏動達到穩定狀態后開始進一步實驗。

1.4 實驗分組與處理 56只成年SD大鼠隨機分為8組(n=7):①缺血/再灌注組(I/R組):全心停灌30 min，用K-H液再灌注15 min;② 雷諾嗪后處理組(RPostC 組):全心停灌 30 min，用含 20 μmol·L－1雷諾嗪的K-H液再灌注10 min，再用K-H液灌注5 min;③ 雷諾嗪+atractyloside組(RA組):用含20 μmol·L－1雷諾嗪 +20 μmol·L－1atractyloside的K-H液再灌注10 min;④ 雷諾嗪+PD98059組(RP 組):用含 20 μmol·L－1雷諾嗪 +10 μmol·L－1PD98059的K-H液再灌注10 min;⑤ 雷諾嗪+wortmannin(RW 組):用含 20 μmol·L－1雷諾嗪 +1 μmol·L－1wortmannin的 K-H 液再灌注10 min;⑥atractyloside 組(A 組):用含 20 μmol·L－1atractyloside的K-H液再灌注10 min;⑦ P組:用含10 μmol·L－1PD98059的K-H液再灌注10 min;⑧ W組:用含1 μmol·L－1wortmannin的 K-H 液再灌注 10 min。RA組、RP組、RW組、A組、P組、W組的余處理同RPostC組。

1.5 取材 再灌注末，立即從灌注架上取下心臟，在冰盤中取左心室缺血區組織，將其剪成3塊稱重。1塊用40 g·L－1多聚甲醛固定，檢測心肌細胞凋亡，另兩塊用鋁鉑紙包好，液氮凍存備用。

1.6 心肌細胞凋亡檢測 用TUNEL法。將多聚甲醛固定的心肌組織常規石蠟包埋并作心肌組織切片(5 μm)，切片經脫蠟、脫水、DAB顯色后，在光鏡下隨機拍攝5個400倍視野，正常細胞核呈藍色，細胞核染成棕黃色即為凋亡陽性細胞，計算平均陽性細胞率，用凋亡指數(AI)反映心肌凋亡程度(AI=凋亡陽性細胞數/總細胞數×100)。

1.7 MPTP開放程度檢測［2］用分光光度計法。用差速離心法提取心肌組織線粒體，用280 nm波長測線粒體濃度并調整線粒體濃度為0.25 g·L－1。平衡2 min后，540 nm波長測吸光度初值(△A1)，加0.25 mmol·L－1CaCl2誘導 MPTP 開放，10 min后吸光度不再變化，記錄此時吸光度值(△A2)。用△A=△A1－△A2表示 MPTP開放程度，△A越小，MPTP開放程度越大。

1.8 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達檢測 用Western blot法，內參照為GAPDH。用Bradford方法測定心肌細胞蛋白含量，取樣品蛋白100μg，經 SDSPAGE電泳、NC轉膜、加入一抗(小鼠抗大鼠 p-AKT、p-ERK1/2或GAPDH單克隆抗體，分別按1∶1 000、1 ∶2 000或1 ∶200)室溫孵育 2 h，PBS洗 5 min×3次，TBS洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室溫封閉1 h，TBS洗5 min×3次，化學發光法顯色，用GelDoc凝膠成像系統中曝光、成像，Quantity one分析軟件分析條帶密度值，用p-AKT、p-ERK 1、p-ERK 2密度值分別與GAPDH密度值的比值表示蛋白表達水平。

2 結果

2.1 雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注心肌細胞凋亡和MPTP開放程度的影響 與IR組比較，RPostC組心肌細胞AI和MPTP開放程度均下降(P<0.05)，其余各組差異均無統計學意義(P>0.05);與 RPostC 組比較，RA、RP、RW、A、P 和 W 組AI和MPTP開放程度均升高(P<0.05);與RA組比較，RP、RW、A、P和W組AI和MPTP開放程度差異均無統計學意義(P>0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of the AI and the opening of MPTPin each group(ˉ±s，n=7)

Tab 1 Comparison of the AI and the opening of MPTPin each group(ˉ±s，n=7)

*P<0.05 vs I/R group;#P<0.05 vs RPostC group

Group AI/% △A I/R 30.04±1.45 0.14±0.02 RPostC 9.95±1.59* 0.34±0.02*RA 28.24±1.03# 0.12±0.01#RP 26.20±1.61# 0.15±0.01#RW 26.50±1.86# 0.13±0.02#A 28.35±0.62# 0.14±0.01#P 29.12±1.35# 0.15±0.01#W 30.12±1.25# 0.15±0.02#

2.2 雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血再灌注心肌細胞p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達的影響 與IR組比較，RPostC、RA、RP 和 RW 組 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達均升高(P<0.05)，A、P和W組差異無統計學意義(P>0.05);與 RPostC 組比較，RP、RW、A、P和W組 p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達均下降(P<0.05)，RA組差異無統計學意義(P>0.05)。與RA組比較，RP、RW、A、P 和 W 組 p-AKT、p-ERK1/2 蛋白表達均下降(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 The expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein in each group(ˉ±s，n=7)

Tab 2 The expression of p-AKT and p-ERK1/2 protein in each group(ˉ±s，n=7)

*P<0.05 vs IR group;#P<0.05 RPostC group;▲P<0.05 vs RA group

Group p-AKT p-ERK1 p-ERK2 I/R 0.42±0.04 0.84±0.05 0.87±0.03 RPostC 0.66±0.03* 1.02±0.04* 1.00±0.02*RA 0.67±0.03* 1.05±0.06* 1.00±0.03*RP 0.51±0.03*#▲ 0.94±0.02*#▲ 0.94 ±0.02*#▲RW 0.52±0.04*#▲ 0.93±0.02*#▲ 0.94 ±0.01*#▲A 0.42±0.05#▲ 0.84±0.03#▲ 0.89 ±0.02#▲P 0.41±0.05#▲ 0.85±0.05#▲ 0.89 ±0.03#▲W 0.42±0.04#▲ 0.85±0.04#▲ 0.89±0.02#▲

Fig 1 The expression of p-AKT and p-TERK1/2 protein in each group

3 討論

缺血后處理是具有明確保護效果的一種內源性保護機制［3～5］，但其臨床應用受限。藥物后處理是用藥物模擬缺血后處理的方式，模擬或者激發缺血后處理中的心肌保護機制或者一些內源性而呈現與缺血后出相似的保護效果，是臨床研究后處理努力的方向。雷諾嗪(ranolazine)是由美國Syntex公司研發［6］的一種不引起血液動力學變化，不引起心率和血壓改變的新型抗心絞痛藥，其減輕心肌缺血/再灌注損傷作用已有文獻報道。我們前期研究證實，雷諾嗪后處理具有明顯的心肌保護效應，并發現其發揮最大心肌保護效應的有效濃度為20 μmol·L－1。另有研究表明［7，8］，大鼠離體心再灌注 15 min末，p-AKT明顯增加，因此，本實驗選擇雷諾嗪20 μmol·L－1和再灌注15 min分別作為實驗濃度和觀察時點。本研究發現，雷諾嗪后處理組的心肌細胞凋亡和凋亡指數明顯低于I/R組，表明雷諾嗪后處理具有抗心肌細胞凋亡作用，與文獻報道一致［9，10］。

MPTP是一個橫跨在線粒體內外膜的孔道，在鈣濃度升高和氧化應激等因素作用下可以誘導其開放，MPTP開放后，小分子溶質自由通過線粒體內膜，線粒體基質中高濃度大分子蛋白產生膠體滲透壓使水進入線粒體，導致線粒體基質腫脹、嵴伸展、外膜破裂，使膜間隙成分如細胞色素C、凋亡誘導因子、Diablo-SMAC等進入胞質，進一步激活caspase-9和 caspase-3，從而誘導細胞凋亡［11，12］。本研究發現，雷諾嗪后處理組較缺血/再灌注組心肌細胞MPTP的開放程度明顯降低，心肌細胞凋亡明顯減少，而用MPTP開放劑atractyloside干預雷諾嗪后處理后，其MPTP的開放程度明顯升高，心肌細胞凋亡也明顯增多，提示雷諾嗪后處理抗心肌細胞凋亡作用與其抑制MPTP開放有關。

RISK途徑是指在再灌注期間發揮抗細胞死亡心臟保護作用的磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，P13K)-AKT和細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERKl/2)前生存激酶的信號級聯［1］，是再灌注時重要的心肌保護靶點之一。研究表明［6］，缺血后處理可通過激活RISK途徑，減輕缺血/再灌注心肌的細胞凋亡。本研究結果表明，雷諾嗪后處理組較缺血/再灌注組p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達明顯升高，心肌細胞凋亡明顯減少，而用 PI3K抑制劑 Wortmmanin和ERK1/2抑制劑 PD9805干預后，p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達明顯下降，心肌細胞凋亡明顯增多，提示雷諾嗪后處理的抗心肌凋亡作用與其進一步激活RISK途徑有關。本研究還發現，用MPTP開放劑atractyloside干預雷諾嗪后處理組，其心肌細胞凋亡明顯增多，MPTP開放程度增大，但p-AKT、p-ERK1/2蛋白表達水平與雷諾嗪后處理組無差異，提示雷諾嗪后處理的抗心肌凋亡作用可能是先通過激活RISK途徑，再進一步抑制MPTP開放實現的，這種作用機制與缺血后處理的RISK-MPTP機制極為類似［6］，說明雷諾嗪后處理可以模擬缺血后處理。

綜上所述，雷諾嗪后處理對大鼠離體缺血/再灌注損傷心肌具有明顯的抗凋亡作用，其機制可能與其激活RISK途徑和抑制MPTP開放有關。

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