丙型肝炎的免疫學研究進展

王東生 姜艷芳 牛俊奇 (吉林大學第一臨床醫學院肝膽胰內科,長春 130021)

丙型肝炎是一種由丙肝病毒引起的肝臟急慢性炎癥,目前世界上約有2億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)[1],中國約有3 700萬～4 000萬[2]。感染者約80%發展成慢性肝炎,在慢性丙肝感染中,HCV不僅導致所感染的肝細胞凋亡,也會干擾肝臟免疫細胞的正常功能,從而免于被免疫系統所清除,同時會導致肝臟免疫病理變化,產生纖維化,最終導致肝癌[3]。HCV感染后大約10%～15%的感染者在感染后能通過病毒特異性免疫應答清除病毒而呈自限性過程。超過80%的HCV感染者不能清除HCV而形成慢性感染,約20%進而發展成為肝硬化、終末期肝病、肝癌等。研究表明,在急性感染的6個月內,迅速而有效的MHCⅠ限制性CD8+應答,協同MHCⅡCD4+T細胞應答可有效的清除HCV,防止慢性丙肝的發生。一般認為,宿主的細胞免疫應答能力強弱對控制HCV感染的慢性化具有重要的作用。

1 丙肝病毒的基因組結構及編碼蛋白的特點

HCV是一種球形帶脂蛋白包膜的病毒,為單股正鏈RNA,基因組全長約9.4 kD,基因組兩側為別為5′和3′非編碼區,中間為開放性讀碼框(ORF)[4],編碼一條含有3 008～3 037個氨基酸的病毒前體多肽蛋白,編碼區從5′端依次為核心蛋白區(C區),包膜蛋白區(E1,E2/NS1),非結構蛋白區(NS2,NS3,NS4A,NS5A和NS5B)[5],C區編碼的核心蛋白與核酸結合組合成核衣殼。E1,E2/NS1區編碼的包膜蛋白為病毒外殼主要成分,可能含有與肝細胞結合的表位,推測其可刺激機體產生保護性抗體。E蛋白的高度變異可導致病毒不斷逃避宿主的免疫應答。病毒的包膜蛋白對于宿主產生體液免疫應答很重要,因為病毒首先接觸的是包膜蛋白,宿主的保護性免疫常依賴于針對病毒表面蛋白的抗體,該抗體能阻斷病毒與敏感細胞的結合,并通過加強細胞免疫清除病毒。NS3區基因區編碼螺旋酶和蛋白酶,NS3蛋白具有強免疫原性,可刺激機體產生抗體[6]。NS5區編碼RNA依賴的RNA多聚酶,在病毒復制中起著重要作用。

2 丙肝病毒免疫學特征研究

HCV感染人體后,機體對病毒的結構蛋白和非結構蛋白產生廣泛的抗體應答,但是這種抗體不能有效地清除HCV感染。通過對黑猩猩的研究顯示,HCV的體液免疫應答具有高度的病毒株變異性,由于HCV的高頻率的變異率,對HCV抗體發生耐受的變異株可逃避機體的體液免疫應答而維持HCV的感染[7]。進一步的研究顯示,HCV的免疫應答主要和細胞免疫相關,其中最主要的是T細胞,包括CD4+T細胞和CD8+T細胞。

2.1 CD4+T細胞的研究HCV的特異性CD4+T應答是保護宿主的重要部分。當HCV感染機體后,病毒抗原多肽和Ⅱ類主要組織相容性復合體(MHC)與CD4+T細胞的受體相結合,將激活 CD4+T細胞。CD4+T細胞對重組病毒蛋白的應答表現為細胞大量增殖和/或分泌細胞因子,清除病毒。Deipolder等[8]通過比較HCV一過性與持續性感染者外周血T細胞應答的研究,首次提出了CD4+T細胞參與清除病毒的免疫應答的可能性。Julian Schulze等[9]人在對31個急性丙型肝炎患者的研究中發現,CD4+T細胞與急性丙型肝炎感染的自發性清除密切相關。而進展成慢性丙型肝炎的患者CD4+T細胞應答常表現為緩慢、低下、而且短暫。當機體缺乏CD4+T細胞應答時,HCV特異性的CTL記憶功能不能維持,導致病毒不能有效地清除。但有研究顯示,慢性丙肝患者體內有效的HCV核心蛋白特異的CD4+T細胞應答與肝臟損傷及疾病活動性的有效控制密切相關。因此,HCV特異性CD4+應答可能參與控制HCV感染,防止肝臟損傷[10]。

2.1.1 調節性T細胞 越來越多的證據顯示調節性T細胞在慢性丙型肝炎的進展中起到重要的作用,尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg,通過對HCV特有的CD8 T細胞的抑制作用,導致疾病的慢性化。近期的研究發現,除了Foxp3的標志外,尚可直接檢測CD127,它的優點是不需破膜而可以直接通過流式檢測。CD127是IL-7Rα鏈受體的一部分,在T細胞前體、B細胞前體、成熟T細胞、成熟單核細胞其他一些淋系和髓系細胞上表達。研究發現IL-7R在淋巴細胞的增殖、分化和成熟中起重要作用,體內實驗發現T細胞活化后CD127蛋白下調表達,并且CD127低表達與CD25高-中表達具有良好的相關性[11]。在急性丙型肝炎自愈的過程中,調節性T細胞CD4+CD127-逐漸減少,而CD4+CD127+逐漸增多。但是慢性丙型肝炎患者體內的CD4+T細胞的水平卻不相同,在感染的24周后,慢性丙型肝炎患者體內的CD4+T細胞幾乎不能被發現,在55%慢性丙型肝炎的患者體內找不到CD127。在早期治療的丙型肝炎患者體內,CD4+T細胞可以被保留下來,在治療成功的時候主要表現為CD4+CD127+。

2.1.2 Th1/Th2細胞研究 CD4+Th細胞是機體重要的免疫調節細胞,根據其產生細胞因子的不同分為Th1和Th2亞型,分別參與調節細胞免疫和體液免疫。Th1和Th2可相互調節,影響免疫應答的格局。Th1細胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β、TNF-α,主要參與細胞介導的免疫應答,如促進巨噬細胞的活化和細胞毒T細胞的殺傷作用,有利于細胞內病毒及細菌的清除。另外,Th1細胞分泌的IFN-γ可抑制Th2細胞的分化和功能。Th2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13,主要功能為促進B細胞發育和介導體液免疫應答,如促進抗體的產生,抑制細胞介導的免疫應答,抑制單核細胞-巨噬細胞的激活等,主要調節體液免疫。另外,Th2細胞分泌的IL-4、IL-10可抑制Th1細胞的分化和功能[12-14]。Th1亞類細胞促進細胞免疫,對細胞毒T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)的功能有輔助作用;Th1類細胞有利于病毒的清除而Th2類細胞主要與組織損傷及慢性化有關[15]。Th1/Th2細胞的調節對維持機體正常的免疫功能至關重要。Th1免疫應答增強宿主對微生物感染,尤其是對病毒和細胞內病原體感染的免疫性和防御功能;而Th2應答則與感染的進展,持續性和慢性化有關,對微生物感染的免疫起到負性調節的作用。Gramenzi[16]等研究了30名慢性HCV感染者外周血中 IL-2、4、10,IFN-γ水平,提示慢性HCV 感染者外周血中Th1免疫應答?？砂殡S較好的臨床后果,而Th2免疫應答常引起慢性持續性肝損傷。

2.2 CD8+T細胞的研究 對HCV急性感染黑猩猩的前瞻性研究發現,CD8+T對丙型肝炎的控制起直接作用,HCV感染早期肝內多種特異性CD8+CTL應答與病毒清除有關。CTLs夠直接識別那些位于被感染細胞表面與MHCⅠ分子結合的病毒抗原肽,通過攻擊靶細胞而清除病毒。它們釋放穿孔素和顆粒酶作用于病毒感染細胞,顆粒酶與穿孔素的協同作用促進病毒感染細胞的死亡。被激活的CTLs逐漸表達 Fas配體(FasL)和 α-TNF,與靶細胞表面的Fas相互識別,從而通過FasL/Fas和TNF-α介導的凋亡途徑破壞靶細胞。在急性HCV感染患者體內存在大量HCV特異性CD8+T細胞,多表現為記憶細胞表型CD28(+)CD45RA(-),比恢復期的高3到5倍[17]。Shoukry NH等[18]通過分析比較以往感染HCV并恢復的猩猩,當再次被HCV感染時,他們能夠迅速獲得病毒特異性的CTL反應,以及CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖,很快控制感染。慢性感染過程中,CD8+T細胞主要識別HCV核心抗原,其分泌IFN-γ的能力顯著低于自限性感染。通過一種特異性T細胞受體(TCR),CD8+T細胞能識別HCV感染細胞表面Ⅰ類MHC分子遞呈的病毒多肽。抗原多肽-MHC復合物激活的CD8+T細胞可通過溶胞和非溶胞作用控制甚至清除病毒[19]。

3 對HCV病毒免疫應答的其它影響因素

3.1 年齡 多項研究證明,年齡的老化與免疫應答的損傷相關。通過檢測外周血淋巴細胞端粒長度來客觀的評價免疫衰退的方法,Matthew Hoare等[20]在141例HCV定量陽性病人抗病毒的研究中發現,隨著慢丙肝病人年齡的老化,預示著其進展為纖維化,以及進展為肝衰竭、肝癌的進程在加速,甚至對抗病毒治療的反應也在減弱,且CD8+、CD4+T淋巴細胞端粒的長度在縮短。

3.2 病毒基因型及準種 由于HCV的高度變異性,基因序列之間存在差異,將不同分離株病毒全基因或有代表性的基因片段核苷酸序列相差25%以上者,劃分為不同的基因型。而在每個基因型內的分離株,分析核苷酸序列的相似性,如果相似性達到77%～80%,則屬于不同的亞型[21]。HCV的這種特性被稱為準種(quasispecies),其原因可能為:①RNA依賴的RNA聚合酶缺乏3′-5′核酸外切酶活性,在復制中產生的錯誤未能糾正[22,23];②宿主免疫選擇作用,使能激發宿主細胞或體液反應的基因區域的變異高于其他部位,這種機制也稱正性選擇作用[24];③病毒的基因結構的限制,病毒的基因結構不同,功能各異,有的區域要求高度保守,否則就產生缺陷性病毒或影響病毒復制及活性,這種機制也稱病毒的負性選擇作用。Simmonds等根據基因序列的差異可將HCV分為6型和11個亞型。HCV基因型分布具有明顯的地域性,其中1型呈全球性分布,占所有HCV感染的70%以上,1b和2a基因型在我國常見,其中以1b型為主[25]。即使是同一個基因型感染,在體內常可檢測到區域的多種變異,進而誘發機體的免疫耐受,導致感染的慢性化。

3.3 治療因素 抗病毒治療在病毒感染的轉歸中起到重要的作用,有效地抗病毒治療可促進病毒的清除,而無效的抗病毒治療可導致病毒發生變異,產生藥物耐受。常用的抗病毒藥物為干擾素及利巴韋林聯合治療。干擾素可刺激HCV特異性CD4+T細胞及CD8+的T細胞免疫應答。利巴韋林是一種合成的嘌呤核苷類似物,具有廣譜DNA及RNA病毒活力。在慢性丙肝患者中,利巴韋林可增強Th1活性,抑制Th2活性[26]。因此,利巴韋林可通過免疫調節功能增強干擾素的抗HCV活性。

3.4 宿主因素 病毒的直接致病作用以及宿主的免疫機制被激活繼而破壞感染的肝細胞是HCV參與致病的過程2種主要機制。盡管病毒本身因素(如病毒變異、基因型)在此過程中起著重要作用,但有研究發現,即使是相同的病毒株感染不同宿主時,其臨床表現也有很大差異。因此,與遺傳相關的免疫因素可能在丙型肝炎的發病過程中起著重要作用。近期的研究表明,在1型丙型肝炎人群中,19號染色體附近的基因的多態性與治療效果有明確的相關性,此變化位于IL28B基因上游約3000個堿基對的位置上,可以有CC、TT、CT等不同的變化。通過對1 671人研究中發現,CC型的病人對治療的反應明顯高于CT及TT型病人。且自愈的患者中多數為CC型病人。充分說明宿主的遺傳在丙肝的發展中起到重要的作用[27]。

4 總結

HCV為一種RNA病毒,其感染人體后可誘發固有免疫應答以及適應性免疫應答。固有免疫應答包括IFN、NK細胞以及巨噬細胞。人體抗病毒的主要機制為病毒特異性的獲得性免疫應答,包括體液免疫及細胞免疫。體液免疫應答由B淋巴細胞表達的抗原識別受體識別病毒的抗原決定簇,而產生病毒特異的抗體。但丙型肝炎的抗體無保護作用,其病毒清除主要依靠細胞免疫應答。細胞免疫應答由T細胞所介導,主要清除病毒感染細胞,同時誘發肝臟損傷。其中CD4+T、CD8+T、調節性T細胞起到重要作用。接近80%的HCV急性感染者會轉成慢性感染性疾病。急性感染康復病人通常免疫系統皆具有強烈的由細胞毒T細胞和輔助性T細胞主導的病毒特異反應能力,而慢性感染病人缺乏有效的針對HCV特異的CD4+T細胞介導的免疫應答。HCV成功地通過一系列連續步驟,干擾人體天然免疫及獲得性免疫系統的抗病毒能力,一方面,HCV通過多種策略,包括干擾免疫細胞信號傳導系統,促進效應細胞功能失調及自身持續遺傳變異相結合的手段來逃逸宿主免疫系統的攻擊。另一方面,宿主的天然及獲得性免疫系統也對HCV的感染主動產生免疫應答(應答的能力減弱),調節性T細胞在病毒清除過程中發揮關鍵性的作用。這些策略的成功實施最終導致HCV在宿主體內成功擴增繁殖及持續感染。故研究HCV感染的免疫學機制對于有效的清除病毒預防免疫應答造成的肝臟損傷具有重要的作用。

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