γ δT細胞誘導與分化的初步研究-Ⅰ①

胡朝英 錢 柳 程偉志 黃秋愉 汪 萍 余奇文 張繼英 陳雪華 張冬青

(上海交通大學醫學院上海市免疫學研究所,上海 200025)

人類γ δ T細胞據其δ鏈可分為δ 1和δ 2兩個亞群,δ 1亞群主要分布于外周器官的粘膜和皮下,在不同的組織部位,其數量不等;δ 2亞群主要存在于外周血中,占T淋巴細胞的0.5%～10%[1,2]。外周血中的γ δ T細胞約占人體總γ δ T細胞的90%以上,且主要取用Vγ 9Vδ 2 TCR基因片段,它能夠直接識別抗原分子而不受MHC分子限制,在固有免疫中發揮重要作用[3,4]。近年來γ δ T細胞是免疫學的一個研究熱點,國內外學者對其分化和功能進行了廣泛深入的研究[5,6],但以動物實驗多見,且集中在抗感染和抗腫瘤等方面[7,8],而有關人類γ δT細胞的亞型分化及免疫調節功能的研究尚處早期。本文旨在應用異戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate,IPP)誘導健康人外周血和新生兒臍帶血γ δT細胞擴增,分析其不同亞型的分化格局,從而進一步豐富對人類γ δ T細胞異質性的認識,為深入研究γ δT細胞與自身免疫病關聯性提供實驗依據,更為應用γ δT細胞干預自身免疫性疾病探索其可能性。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本實驗所用的人外周血細胞均來自本校健康學生志愿者,共15名,其中男8名,女7名;年齡18～35歲;新生兒臍帶血來自婦幼保健院足月自然分娩健康新生兒結扎剪斷臍帶后臍靜脈采血。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養基(Gibco,BRL);胎牛血清(FBS,Gibco);IL-2(Roche);異戊烯焦磷酸(Sigma);結核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)由蚌埠醫學院李柏青教授惠贈;γ δ TCR,CD4,CD8磁珠分選試劑盒(Miltenyi Biotec);抗 CD3-FITC/PerCP,抗 γ δ TCR-PE,抗 γ 9-FITC,抗 δ 2-FITC/PE,抗 CD80/86-FITC,抗HLADR-PE/PE-Cy5,抗 CD69-PE,抗 CD27-PE,抗CD45RA/RO-PE-Cy5(所有熒光標記單抗均購自BD公司);淋巴細胞分離液(LymphoprepTM,Axis-shield)。1.3 實驗方法

1.3.1 細胞分選 密度梯度離心法分離全血獲取外周血單個核細胞(PBMC)和臍帶血單個核細胞(CBMC)。部分PBMC經γ δ TCR磁珠分選獲取γ δT細胞(純度大于90%),用于細胞增殖實驗的效應細胞;余陰選細胞經CD4和CD8磁珠分選去除CD4+T細胞和CD8+T細胞后,用于增殖實驗的輔佐細胞。部分PBMC和全部CBMC用于流式分析細胞表型和細胞培養。

1.3.2 細胞增殖實驗 將磁珠分選得到的γ δT細胞用含20%FBS的RPMI1640培養基稀釋成1×106ml-1,加入 96孔培養板,每孔 100 μ l;含或不含 IL-2(20 U/ml)、不同濃度的 IPP(0.08 、0.8、3.2、8.0、20、80.0 μ g/ml)或 Mtb-Ag(20.0 μ g/ml)[9]的 RPMI1640培基每孔50 μ l;將輔佐細胞用RPMI1640培養基稀釋成4×105ml-1,每孔 50 μ l,37℃、5%CO2 飽和濕環境中培養。6天后加入3[H]-TdR 1μ Ci/孔,繼續培養16小時后,收集細胞,β液閃計數儀測定3[H]-TdR摻入量,結果以每分脈沖數(cpm)表示。

1.3.3 細胞培養 將PBMC和CBMC分別用含10%FBS、IL-2(5 U/ml)和最佳濃度IPP的 RPMI 1640培養基稀釋成1×106ml-1,加入24孔培養板,每孔1 ml,37℃、5%CO2飽和濕環境中培養。

1.3.4 γ δ T細胞誘導前后的表型分析 流式細胞術分析γ δ T細胞在健康人外周血和新生兒臍帶血T細胞中的比例、Vγ 9Vδ 2 T細胞亞群在 γ δ T 細胞中的分布及其亞型;檢測IPP誘導后γ δ T細胞的比例,同時分析Vγ 9Vδ 2 T細胞的亞型和表型變化。流式細胞儀檢測結果使用BD CellQuest軟件進行分析。

圖1 外周血和臍帶血γ δT細胞數量及亞群的異質性Fig.1 The heterogeneity of γ δT cells in the quantity and subgroups between peripheral blood and cord blood

1.4 統計學分析 所有數據均使用Prism(Graph-Pad)軟件進行分析。用雙側配對 t檢驗對兩組數值進行比較;用方差分析處理組內數據;將P＜0.05視為有統計學差異并在圖中進行標注(*.0.01＜P＜0.05;**.0.001＜P＜0.01;***.P＜0.001)。

2 結果

2.1 外周血和臍帶血γ δT細胞數量及亞群的異質性 外周血 γ δ T細胞比例明顯高于臍帶血 γ δT細胞的比例,前者為6.161±1.456,后者為1.644±0.307,兩者具有統計學差異(圖1A);外周血和臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細胞亞群比例差異顯著(17.98±6.07,91.39±6.67)且其各亞型分布格局不同(圖1B、C)。2.2 IPP誘導γ δ T細胞的擴增存在劑量依賴 微量濃度IL-2具有協同IPP對γ δT細胞的促增殖作用。IPP誘導γ δ T細胞增殖效能以2 μ g/ml協同微量IL-2(5 U/ml)作用最顯著。如圖2所示。

圖2 IPP誘導γ δT細胞擴增呈劑量依賴Fig.2 IPP-induced expansion of γ δT cells is dose-dependent

2.3 IPP對臍帶血γ δ T細胞的誘導作用 在 IPP作用下,外周血 γ δT細胞比例明顯增高,且大部分Vγ 9Vδ 2 T細胞被活化成效應記憶型(CD27-CD45RA-);IPP同樣誘導臍帶血γ δT細胞擴增,但不同的是Vγ 9Vδ 2 T細胞雖趨向中央記憶型(CD27+CD45RA-)和效應記憶型(CD27-CD45RA-)分化,但仍以幼稚型(CD27+CD45RA+)為主,見圖3。

2.4 IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細胞特征 被IPP活化的外周血Vγ 9Vδ 2 T細胞的特征之一在于高表達HLA-DR和 B7分子(圖4)。而臍帶血Vγ 9Vδ 2 T細胞表面HLA-DR和B7分子也有一定程度的表達。

圖3 IPP對γ δT細胞的誘導作用Fig.3 γ δT cells induced with IPP

圖4 IPP活化的外周血Vγ 9V δ 2 T細胞表型特征Fig.4 The phenotype characteristic of PB V γ 9Vδ 2 T cells activated by IPP

3 討論

人類γ δ T細胞根據其TCRγ、δ鏈的不同組合可分為多個亞群,由于其亞群的異質性而呈現了不同的生物學特性[3,10]。最初人們對γ δ T細胞的認識只限于其在固有免疫中的作用,然而自上個世紀八、九十年代,越來越多的研究發現γ δT細胞在適應性免疫中同樣扮演著重要的角色。因此對于γ δ T細胞的定義,就有“第一道防線”,“調節細胞”或“先天性和適應性免疫應答之間的橋梁”等,但這些都只是描述了其復雜行為的某一層面[11]。事實上,在胸腺和外周組織中,γ δ T細胞的發育受其它免疫活性細胞的影響,形成了一個具有獨特生物學特征的淋巴細胞亞群系統,對健康組織、免疫細胞,病原體持續感染的組織以及宿主對病原體的免疫應答都有很多直接或間接的影響。近年來,γ δT細胞具有的專職性抗原遞呈細胞的特性已成為人們研究的熱點。Moser等研究了人扁桃體來源的γ δT細胞,發現其具有專職性抗原遞呈細胞的表型和功能[12,13];隨后國內外科學家陸續在小鼠和牛的實驗中也發現了這一現象[14,15]。此外 ,γ δT細胞通過分泌 IL-17、IFN-γ等細胞因子在感染性疾病和腫瘤中的作用也再次受到關注[16-18]。目前發現γ δT細胞在感染免疫、自身免疫和腫瘤免疫中都發揮著重要的作用[19,20],可見γ δT細胞是一種“全能細胞”,與人類的很多疾病都有或多或少的聯系,有很大的研究空間和臨床價值。

由于γ δT細胞在外周血中數量很少,為我們深入研究其分化過程和生物學功能帶來一定困難,目前已有多種擴增外周血中γ δT細胞的方法[21,22],特別是何維教授的課題組成功建立了一例健康人γ δT細胞的克隆[23]。本課題組一直致力于應用臍帶血為 γ δ T 細胞的來源,尤其是研究 γ δT 細胞的分化 。若能從新生兒臍帶血擴增出γ δ T細胞必將為我們提供豐富的細胞來源,為進一步研究γ δT細胞奠定實驗基礎。本文通過對外周血和臍帶血中γ δ T細胞的誘導活化擴增,分析兩者的差異及其不同階段的表型特征,以期確定發揮抗原遞呈作用的主要亞型以及此亞型的其它生物學功能,為探索其與臨床疾病的關聯性打下基礎。

本實驗結果表明外周血和臍帶血γ δ T細胞在數量、亞群諸方面都有明顯的差異,且二者對IPP的反應性不同。外周血γ δ T細胞被有效地活化成效應記憶型的同時,高表達抗原遞呈相關的表面分子。由于臍帶血來源的γ δT細胞主要是幼稚型細胞,在體外培養過程中,仍需相關細胞因子(如:IL-7、IL-15等[24,25])的協同作用,才能完全呈現出其分化成熟為可用于理論研究和臨床實驗的效應記憶型γ δ T細胞的潛能。

本文旨在報道我們對γ δ T細胞分化和表型分析的前期研究,為深入研究γ δ T細胞的功能,尤其是其抗原遞呈作用做一鋪墊,更為將γ δT細胞用于免疫調節和干預自身免疫病與腫瘤提供實驗依據。

真誠感謝蚌埠醫學院李柏青教授的指導和惠贈結核桿菌多肽抗原(Mtb-Ag)。

1 Fischer S,Scheffler A,Kabelitz D.Activation of human gamma delta T-cells by heat-treated mistletoe plant extracts[J].Immunol Lett,1996;52(2-3):69-72.

2 胡朝英,張冬青.γ δ T細胞的專職性抗原遞呈作用[J].細胞生物學雜志,2008;31(3):344-348.

3 Beetz S,Wesch D,Marischen L et al.Innate immune functions of human gammadelta T cells[J].Immunobiology,2008;213(3-4):173-182.

4 Kabelitz D,Glatzel A,Wesch D.Antigen recognitionby human gammadelta T lymphocytes[J].Int Arch Allergy Immunol,2000;122(1):1-7.

5 Dieli F,Poccia F,LippM et al.Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes or inflammatory sites[J].J Exp Med,2003;198(3):391-397.

6 Ferlazzo V,Sferrazza C,Caccamo N et al.In vitro effects of aminobisphosphonates on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and differentiation[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2006;19(2):309-317.

7 Gong F,Ma Y H,Ma A L et al.A lectin from Chinese mistletoe increases γ δT cell-mediated cytotoxicity through induction of caspase-dependent apoptosis[J].Acta Biochim Biophys Sin,2007;39(6):445-452.

8 Ma Y H,Cheng W Z,Gong F et al.Active chinese mistletoe lectin-55 enhances colon cancersurveillance through regulating innate and adaptive immune responses[J].World J Gastroenterol,2008;14(34):5274-5281.

9 陳 勇,呂合作,李柏青 et al.純化的結核桿菌多肽抗原刺激人γ δ T細胞的效應分析[J].分子與細胞免疫學,2004;20(10):661-664.

10 Hayday A C.[gamma][delta]cells:a right time and a right place for a conserved third way of protection[J].Annu Rev Immunol,2000;18:975-1026.

11 Born W K,Reardon C L,O'Brien R L.The function of gammadelta T cells in innate immunity[J].Curr Opin Immunol,2006;18(1):31-38.

12 BrandesM,Willimann K,Moser B.Professional antigen-presentation function by human gammadelta T cells[J].Science,2005;309(5732):264-268.

13 Moser B,Brandes M.Gammadelta T cells:an alternative type of professional APC[J].Trends Immunol,2006;27(3):112-118.

14 Lan C,Yan C,Hui S et al.Mouse γ δT cells are capable of expressing MHC classⅡmolecules,and of functioning as antigen-presenting cells[J].J Neuroimmunology,2008;203(1):3-11.

15 Collins R A,Werling D,Duggan S E et al.γ δT cells present antigen to CD4+α β T cells[J].J Leuko Bio,1998;63(6):707-714.

16 Roark C L,Simonian P L,Fontenot A P et al.gammadelta T cells:an important source of IL-17[J].Curr Opin Immunol,2008;20(3):353-357.

17 Umemura M,Kawabe T,Shudo K et al.Involvement of IL-17 in Fas ligand-induced inflammation[J].Int Immunol,2004;16(8):1099-1108.

18 Umemura M,Yahagi A,Hamada S et al.IL-17-mediated regulation of innate and acquired immune response against pulmonary Mycobacteriumbovis bacille Calmette-Guerin infection[J].J Immunol,2007;178(6):3786-3796.

19 Kabelitz D,Wesch D,He W.Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology[J].Cancer Res,2007;67(1):5-8.

20 高學平,宋秀宇,陳 勇 et al.γ δ T細胞的細胞毒活性研究[J].腫瘤,2001;21(2):94-97.

21 陳復興,劉軍權,馮 霞 et al.一種體外擴增人γ δT細胞的新方法[J].細胞與分子免疫學雜志,2007;23(7):662-664.

22 王克強,侯彥強,李 雁.一種簡單快速擴增和獲取外周血γ δT細胞的方法[J].中國實驗血液學雜志,2004;12(3):372-374.

23 何小鵑,康寧,陳 慧 et al.一株健康人γ δT細胞克隆的建立及鑒定[J].基礎醫學與臨床,2009;29(1):24-28.

24 Laky K,Lewis J M,Tigelaar R E et al.Distinct requirements for IL-7 in development of TCRγ δcells during fetal and adult life[J].J Immunol,2003;170(8):4087-4094.

25 Rochman Y,Spolski R,LeonardW J.New insights into the regulation of T cells by γ c family cytokines[J].Nature Reviews Immunology,2009;9(7):480-490.