纖維蛋白原Bβ多位點基因多態性與其功能表達和腦梗死類型的關系

元小冬 王淑娟 許亞茹 李 靜 楊 娜 李宏芬

(華北煤炭醫學院附屬開灤醫院神經內科,唐山 630000)

血漿纖維蛋白原(Fg)濃度和分子聚合活性異常是缺血性腦血管疾病的重要危險因素,Fg作為一種主要由肝臟合成的大分子糖蛋白,每個單位由3對對稱排列的多肽鏈Aα、Bβ和γ組成,它的合成、分泌和分子活性受遺傳和環境因素的影響[1-3],而Fg合成的基因調控是其重要的遺傳決定因素,同時Fg基因多態性作為腦梗死疾病的遺傳易感因素已引起了廣泛的重視。目前認為FgBβ鏈的mRNA合成是控制Fg整個分子合成的限速步驟,同時已發現FgBβ鏈有多個基因多態性位點,它們可能與Fg合成的基因調控和功能表達有關,但其具體機制尚不清楚。本項研究通過對不同類型腦梗死患者FgBβ鏈5′端啟動子區、翻譯區和3′端非翻譯區六個主要代表性多態性位點的基因多態性與血漿Fg濃度和分子聚合活性功能表達等相關因素進行研究,分析FgBβ鏈主要基因多態性位點等遺傳因素對血漿Fg功能表達的基因調控作用及其與腦梗死類型的關聯性,從而探討不同類型腦梗死的發病機制,尋找腦梗死發病的可能遺傳基礎,從而為腦梗死高危人群的風險預測和制定個體化防治方案提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組的選取 選取在開灤醫院神經內科住院并經臨床和頭CT或MRI掃描證實的急性腦梗死患者160例,依據頭CT或MRI顯示病灶的形態學特征將其分為兩組[4]:①腦動脈主干支梗死組(Main-trunk arterial cerebral infarction,MCI,n=54):男39例、女15例,年齡(63.25±14.07)歲,CT顯示的病灶主要分布于額、顳、頂、枕各腦葉的皮層或皮層下,其病灶呈扇形、楔形大片低密度影或相應MRI表現。②腦動脈穿通支梗死組(Penetrating arterial cerebral infarction,PCI,n=106):男74例 、女32 例,年齡(63.94±11.48)歲,CT顯示病灶主要為分布于內囊、殼核、尾狀核、丘腦附近及側腦室旁,形態呈類圓形或橢圓形的小軟化灶或有相應的MRI表現。

1.1.2 正常對照組的選取 選取同時期在開灤醫院進行健康查體,并與病例組在年齡和性別等方面相匹配,且檢查結果均正常的志愿者160人,其中男113例、女47例,年齡(65.05±8.73)歲。所有樣本已除外有明確腫瘤和其它明顯腦動脈栓子來源的患者。

1.2 實驗室檢測

1.2.1 血生化及Fg濃度及分子聚合活性系列指標的測定 病例組均于發病24小時內、對照組于體檢

當日抽取清晨空腹靜脈血8～10 ml,其中3 ml以3 000 r/min離心10分鐘,吸取血清應用全自動生化儀測定血糖(Glu)、谷丙轉氨酶(ALT)、甘油三脂(TG)、膽固醇(CHO)、極低密度脂蛋白(VLDL)等項血生化指標;另取3 ml,加0.13 mol/L枸櫞酸鈉抗凝劑0.3 ml混勻,以2 000 r/min離心 10分鐘,吸取血漿測定Fg濃度、纖維蛋白單體聚合速率(FMPV)、最大光密度值(Amax)、FMPV/Amax等指標[5]。

1.2.2 FgBβ鏈六位點的基因型檢測 將剩余血標本加2%EDTA 0.3 ml抗凝,低滲法分離白細胞,酚/氯仿法提取DNA,然后應用聚合酶鏈反應(PCR)擴增目的DNA,引物序列見表1;PCR擴增體系:PCR總反應體系為25 μ l,其中雙蒸水 15.1 μ l,10×Buffer 2.5 μ l,MgCl2溶液 1.6 μ l(2.5 mol/L),4×dNTP 混合物 2 μ l,上游引物和下游引物 2 μ l,Taq 酶 0.8 μ l,模板DNA為1 μ l;PCR循環條件:94℃預變性240秒→94℃變性60秒→60℃退火 60秒→72℃延伸90秒,循環30次,72℃后延伸300秒。

1.2.2.1 限制性內切酶酶切PCR擴增產物 Bβ-854酶切體系 20 μ l,其中雙蒸水 7 μ l、PCR 產物 10 μ l、EcoRI內切酶 1 μ l(10 U)、EcoRI 緩沖液 2 μ l;Bβ-455 酶切體系 20 μ l,其中無菌去離子水 9 μ l、Buffer 2 μ l、HaeⅢ 1 μ l、擴增產物 8 μ l,37 ℃水浴 12 小時;Bβ-249 酶切體系 20 μ l,包括無菌去離子水 9 μ l、Buffer 2 μ l、Bsp1286I 1 μ l、擴增產物 8 μ l,37 ℃水浴 12 小時;Bβ-148 酶切體系 20 μ l,其中雙蒸水 13 μ l、BufferE 2 μ l、BSA 0.2 μ l、Hind Ⅲ0.8 μ l(8 U)、擴增產物 4 μ l,37℃水浴 16 小時 ;Bβ448 酶切體系 20 μ l,其中雙蒸水 13.2 μ l、MnlⅠ 0.8 μ l(8 U)、BufferG 2 μ l、擴增產物4 μ l,37℃水浴16 小時 ;Bcl-1酶切體系20 μ l,其中雙蒸水 7 μ l、BufferG+緩沖液 2 μ l、Bcl-1 內切酶 1 μ l(10 U)、擴增產物 10 μ l,37℃水浴16小時。

1.2.2.2 DNA定性 將酶切產物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察記錄Fg六個多態性位點的各基因型(順序為野生型、變異雜合子、變異純合子):Bβ-854、-455、Bcl-1 及 448 均為 GG 、GA 、AA 型;FgBβ-249、-148 則可見 CC、CT、TT 三種基因型。

1.3 資料的統計學分析 全部資料應用Excel建庫,將所有非定量指標數量化,采用SAS(8.12)統計軟件包進行統計學分析。FgBβ鏈基因位點之間的遺傳連鎖不平衡關系進行Kappa一致性檢驗分析。

2 結果

2.1 研究對象的臨床資料分析 三組年齡、性別構成無顯著性差異(F=0.70,P=0.4997,χ2=0.158,P=0.924),MCI和PCI組收縮壓、舒張壓、體重指數、TG、GLU、VLDL 、FMPV 均高于對照組;MCI組 Fg濃度、FMPV/Amax高于對照組,TG、VLDL低于PCI組(表2)。

2.2 FgBβ各位點等位基因分布與腦梗死類型的關系 根據基因記數方法計算等位基因頻率,Bβ-854 A和Bcl-1A等位基因在MCI、PCI組和對照組間分布頻率有統計學差異(19%,17%,10%;21%,17%,16%;P＜0.05),其余位點各組間等位基因分布頻率均無顯著性差異(P＞0.05)。同時,對于腦梗死組和對照組六個位點等位基因進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗,除Bβ-455等位基因分布頻率不符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=4.262,P＜0.05;χ2=11.472,P＜0.05)外,其余五個位點期望值與觀察值之間無顯著性差異(P＞0.05),分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.3 FgBβ各位點基因型和連鎖基因型與腦梗死類型的關系 FgBβ-854、Bcl-1為GG型分布頻率占優勢,MCI和PCI組的GA、AA型分布頻率高于對照組(-854χ2=15.004 1,P=0.004 7;χ2=0.478 5,P=0.033 1);其余位點各組間基因型分布差異均無顯著性(P＞0.05)(表3)。因Fg Bβ各位點變異純合子基因型樣本較少,故將其與變異雜合子基因型進行并組分析。進行Kappa一致性檢驗分析顯示Fg Bβ-854G/A 與-455G/A、-249C/T 及 Bcl-1C/T 之 間,Bβ-249 C/T 與-148C/T、Bcl-1G/A 之間為隨機分布;Bβ-854G/A 與-148C/T、448G/A,-249C/T 與-455G/A、448G/A之間一致性極差,近于隨機分布;BβBcl-1C/T與-455G/A、-148C/T之間為松散連鎖不平衡關系;Bβ-455G/A 與-148C/T、448G/A、-148C/T 與 448G/A之間存在強連鎖不平衡關系。三組 Bβ-455、-148、448各連鎖基因型分布頻率的差異無顯著性(P＞0.05)。

2.4 FgBβ六位點基因多態性與Fg系列指標及腦梗死類型的關系 FgBβ-854G/A在對照組和PCI組中GG和GA+AA型人群間Fg濃度、FMPV、Amax及FMPV/Amax無統計學差異(P＞0.05),MCI組也僅GA+AA型的Amax高于GG型(0.21±0.03,0.19±0.03,P＜0.05),其余指標亦均無統計學差異(P＞0.05);Bβ-455G/A在三組中GG和GA+AA型人群間Fg濃度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均無統計學差異(P ＞0.05);人群間 Fg濃度 、FMPV 、Amax、FMPV/Amax無統計學差異(P＞0.05),在MCI組CT+TT型人群Fg、FMPV低于CC型(403±88.68,501±43.34;0.72±0.12,0.83±0.06;P＜0.05),其余指標CT+TT型和CC型間無差異 (P＞0.05);Bβ-148C/T在對照組CT+TT型人群Amax高于CC型人群(0.20±0.12,0.16±0.04;P＜0.05),PCI組CT+TT型人群FMPV/Amax高于CC型(3.81±0.36,3.65±0.42;P＜0.05),MCI組CT+TT型與CC型人群間 Fg各指標均無差異性(P＞0.05);Bβ448G/A在對照組和PCI組GA+AA型與GG型人群間Fg系列指標均無差異性(P＞0.05),MCI組GA+AA型人群Fg、FMPV高于GG型(450±85.63,398±88.47;0.78±0.12,0.71±0.11;P＜0.05)。BβBcl-1G/A在對照組GA+AA型Fg濃度高于GG型(420±83.97,369±95.09;P＜0.05),其余指標在GA+AA型和GG型間無差異(P＞0.05);在PCI組GA+AA型FMPV高于GG型(0.74±0.11,0.69±0.11;P＜0.05),其余指標GA+AA型和GG型間無差異(P＞0.05);MCI組GA+AA型和GG型間Fg濃度、FMPVAmax、FMPV/Amax無統計學差異(P＞0.05)。

表1 PCR各基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of six genes

表2 不同類型腦梗死與對照組的臨床指標比較(±s)Tab.2 The clinical indicators comparison of different cerebral infarction types with the control group( ±s)

表2 不同類型腦梗死與對照組的臨床指標比較(±s)Tab.2 The clinical indicators comparison of different cerebral infarction types with the control group( ±s)

Note:Application analysis of SNK:1),2),3)indicated that there were significant differences between the MCI group and the control group,the PCI group and the control group,the MCI and the PCI group,respectively(P＜0.05).

Indicators MCI cases(n=54) PCI cases(n=106) Controls(n=160) F P Age(y) 63.25±14.07 63.94±11.48 65.05±8.73 0.70 0.499 7 SBP(mmHg) 150.56±28.52 150.08±25.61 125.89±12.891)2) 55.31 ＜0.000 1 DBP(mmHg) 85.71±12.84 87.05±13.72 79.15±8.271)2) 18.29 ＜0.000 1 BMI(kg/m2) 24.98±9.75 25.29±10.44 22.91±6.471)2) 20.08 ＜0.000 1 TG(mmol/L) 1.48±0.86 1.82±1.06 1.21±0.611)2)3) 17.49 ＜0.000 1 CHO(mmol/L) 5.34±1.38 5.35±1.36 5.11±0.95 1.66 0.191 2 GLU(mmol/L) 6.08±2.44 6.50±3.39 4.87±0.741)2) 18.12 ＜0.000 1 VLDL(mmol/L) 0.30±0.17 0.36±0.21 0.24±0.121)2)3) 17.52 ＜0.000 1 Fg concentration(mg/dl) 418.17±87.11 399.09±89.59 379.59±94.141) 3.97 0.019 9 FMPV 0.74±0.12 0.71±0.12 0.64±0.181)2) 11.89 ＜0.000 1 Amax 0.20±0.03 0.20±0.05 0.19±0.10 0.43 0.652 5 FMPV/Amax 3.80±0.80 3.70±0.43 3.65±0.441) 2.55 0.079 4

表3 FgB β各位點基因型與腦梗死類型的關系Tab.3 Relationship between the six sites'genotypes and cerebral infarction types

表4 以腦梗死與否為因變量的Logistic回歸分析結果Tab.4 Logistic regression analysis of cerebral infarction as the dependent variable

表5 以PCI為因變量的Logistic回歸分析Tab.5 Logistic regression analysis of PCI as the dependent variable

2.5 Fg系列指標的多因素分析結果 以Fg濃度為因變量進行多元逐步回歸分析,依次篩選出腦梗死類型、年齡、FMPV/Amax、Bcl-1基因型,標準化回歸系數(β)分別為 0.11、0.12、0.16、0.20,P ＜0.01;以FMPV為因變量依次篩選出腦梗死類型、Amax、-249基因型 ,β 為 0.27、0.29、-0.13,P ＜0.01;以Amax為因變量僅篩選出FMPV,β為0.32,P＜0.01;以FMPV/Amax為因變量則依次篩選出腦梗死類型、飲酒 、TG 、Fg 濃度 、-148基因型 ,β為 0.12、-0.17、0.16、0.15、0.16,P ＜0.01 。

2.6 腦梗死類型的影響因素分析 以腦梗死與否為因變量的Logistic回歸分析依次篩選出吸煙史、SBP 、BMI、Glu、FMPV 、Bcl-1(表 4);以 MCI(MCI為 1,對照為 0)為因變量篩選出吸煙史、SBP、BMI、Glu、FMPV、Bcl-1,OR 值分別為 10.07、1.08、1.17、1.78、68.46、4.08;以PCI為因變量則篩選出吸煙史、SBP、BMI、Glu 、VLDL 、FMPV(表 5)。

3 討論

本項研究各組間的年齡、性別構成比無顯著性差異,表明MCI組、PCI組及對照組的資料選擇匹配,具有可比性。本項研究發現MCI和PCI組的收縮壓、舒張壓、體重指數、TG、Glu、VLDL、FMPV 均高于對照組,提示這些因素是腦梗死疾病的危險因素;而MCI組 Fg濃度、FMPV/Amax高于對照組,TG、VLDL低于PCI組,說明PCI患者血漿Fg單體的聚集功能增強,同時具有以TG為主的血脂代謝異常,而MCI患者不但血漿纖維蛋白單體的聚合功能增強,而且具有血漿Fg含量升高和Fg分子活性增強,因此血漿Fg濃度、FMPV/Amax及FMPV同時異常是MCI的獨立危險因素,而僅有FMPV和TG異常則是發生PCI的危險因素。這與文獻報道血漿Fg含量及其分子聚合功能異常是腦梗死疾病重要危險因素的結果相同[6-10]。

腦梗死組和對照組六個位點等位基因的Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗結果表明,除Bβ-455等位基因的分布頻率外,其余五個位點均符合Hardy-Weinberg平衡,表明本項研究選擇的樣本具有可靠性和群體代表性,而多態性位點的基因遺傳連鎖不平衡分析顯示 Bβ-455G/A與-148C/T和 448G/A,-148C/T與448G/A之間存在著強連鎖不平衡關系,因此我們進行這些位點的連鎖基因型分析,結果顯示三組 Bβ-455、Bβ-148 、Bβ448 之間各連鎖基因型的分布頻率無統計學差異,從而提示這些存在強連鎖不平衡關系位點間的連鎖基因型與腦梗死類型無明顯的相關性。

目前的研究表明血漿Fg濃度和分子聚合功能的表達主要通過Fg的基因進行調控[11-14],Fg的三對多肽鏈分別由其各自獨立轉錄的mRNA指導合成,其中Bβ鏈mRNA的合成是整個Fg分子合成的限速步驟,而其具有多態性的位點可能是其基因表達的重要調控部位。在FgBβ鏈轉錄起始點上游,即5′端啟動子區存在著多個調控區和位點,其中本項研究的FgBβ-854、-455、-249、-148 均位于此區。由上述單因素及多因素分析結果發現FgBβ鏈5′端啟動子區僅Bβ-854等位基因A和變異基因型與腦梗死疾病有關,Bβ-854和-455位點基因多態性對于血漿Fg濃度及分子聚合活性的功能表達沒有明顯的調控作用,但在某些情況下可引起纖維蛋白單體最大聚合速率發生異常,而易發MCI,而Bβ-455與腦梗死的類型也無明顯的關系;同時Bβ-249基因多態性是調控血漿FMPV功能表達的重要位點,吸煙可使其野生型的功能表達增強,而變異基因型的功能表達減弱而呈保護作用;Bβ-148則是調控血漿Fg分子聚合功能的重要位點,當其FMPV/Amax表達增強時易發PCI。

在FgBβ鏈翻譯區的448基因多態性位點顯示在三組間的等位基因分布頻率無顯著差異性,提示FgBβ翻譯區448位點在三組間的等位基因和基因型的頻率分布趨勢相同,與腦梗死疾病類型無明顯的關系。同樣,Bβ448變異基因型與野生型人群間Fg系列指標在對照組和PCI組中均無差異性,但MCI組的變異基因型人群Fg、FMPV高于野生型,多因素分析沒有發現此位點的基因多態性與血漿Fg濃度和分子功能表達有關,說明在正常情況下翻譯區448位點基因多態性與血漿Fg濃度和分子功能表達無關系,但在MCI時其變異基因型人群具有血漿Fg濃度和纖維蛋白單體聚合速率的表達增強。

本項研究顯示在FgBβ鏈3′端的Bcl-1位點等位基因A和變異基因型與腦梗死類型有關;在對照組Bcl-1變異基因型僅Fg濃度高于野生型,且以血漿Fg濃度為因變量進行多元逐步回歸分析依次篩選出腦梗死類型、Bcl-1G/A、年齡,這證實Bcl-1位點是血漿Fg濃度表達的重要基因調控位點和影響腦梗死類型的重要因素,在變異基因型和年齡增大時其表達增強;另外,PCI組變異基因型僅FMPV高于野生型;以有無腦梗死為因變量進行logistic回歸分析發現吸煙 、SBP 、BMI、Glu 、FMPV 、Bcl-1 是其重要影響因素,且后兩者的危險度為41.09、2.28,同樣以MCI為因變量也篩選出上述六個因素,但后兩者的危險度分別上升到68.46、4.08,而且吸煙的危險度也由7.63上升到10.07,以PCI為因變量則篩選出吸煙、VLDL、FMPV等因素,其危險度分別達7.27、19.43、26.19,而未發現各多態性位點與之有相關性,這進一步證明腦梗死是遺傳和環境因素共同作用所致,Bcl-1變異基因型人群是腦梗死疾病,尤其是MCI的遺傳易感人群,其變異基因型在吸煙、血脂代謝異常等特定條件下可使血漿纖維蛋白單體聚合功能表達增強易發PCI,而在血漿Fg濃度和纖維蛋白單體聚合功能表達均增強時則易發MCI。

綜上所述,血漿Fg濃度、FMPV/Amax及FMPV同時異常是MCI的獨立危險因素,而僅FMPV和TG異常是PCI的危險因素;5′端啟動子區Bβ-854A等位基因攜帶者是腦梗死的易感人群,Bβ-249C/T是影響血漿FMPV功能表達的重要位點,其變異基因型可使血漿FMPV功能表達減弱而呈現保護作用,吸煙可使其野生型的功能表達增強;Bβ-148位點是調控血漿Fg分子聚合功能的重要部位,并與腦梗死的類型有明顯關聯性;FgBβ翻譯區448位點與腦梗死疾病類型無明顯的關系;3′端Bcl-1位點是血漿Fg濃度表達的重要基因調控位點,其變異基因型人群是腦梗死疾病,尤其是MCI的遺傳易感人群,變異基因型在吸煙、血脂代謝異常等特定條件下可使血漿纖維蛋白單體聚合功能表達增強易發PCI,而在血漿Fg濃度和纖維蛋白單體聚合功能表達均增強時則易發MCI,因此,腦梗死疾病是遺傳和環境因素共同作用的結果。

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