HIF-1α和VEGF在佐劑性關節炎大鼠膝關節滑膜的表達

徐育冬 宋新梅 靳洪濤 張紹君 (河北醫科大學第二醫院風濕免疫科,石家莊 050000)

血管新生在胚胎發生和創傷愈合中是一個基本生理過程,但在類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)、腫瘤、糖尿病視網膜病變和銀屑病等病理過程中也具有重要作用[1]。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧誘導因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在促進滑膜局部血管新生中具有重要作用,血管增殖確保了滑膜血管翳的發生和成長,是RA發生和發展的中心環節,并且促進了軟骨和骨的破壞及關節重塑,最終造成關節畸形和強直,功能喪失。關節炎動物實驗表明,在RA的過程中阻斷血管生成是一種有效的治療方法[2]。本實驗旨在觀察佐劑性關節炎大鼠(AA)膝關節滑膜VEGF、HIF-1α的表達。為RA滑膜血管翳形成尋找實驗證據及臨床抑制RA滑膜血管翳生成提供理論依據及有效切入點。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 Wistar大鼠30只,雄性,體重140～160克,由河北省實驗動物中心提供,合格證號802120,許可證號SCXK(冀)2003-1-003。

完全弗氏佐劑(FCA,10 ml)購于Sigma公司;VEGF、HIF-1α免疫組化成套試劑盒購自深圳晶美生物制品公司;卡介苗(BCG,50 mg/支)購自華瑞創新生物科技開發中心。

1.2 分組及AA大鼠模型的建立 將30只雄性Wistar大鼠隨機分為2組,設正常對照組10只,造模組20只。將FCA與卡介苗配置為(含BCG 10 mg/ml)的水包油乳劑。試驗第一天造模組20只大鼠的尾根部皮內注射該乳劑0.2 ml致炎,正常對照組大鼠的尾根部皮內注射等量生理鹽水。

1.3 病理學及免疫組織化學檢測 于致炎后第28天,處死所有大鼠并取膝關節滑膜組織,置于4%多聚甲醛固定液中固定,以備作病理及免疫組織化學檢測。常規HE染色并計算滑膜病理積分,按照炎癥程度不同分別評分[3]:0分:正常;1分:極少炎性細胞浸潤或(和)組織輕微水腫;2分:輕微浸潤;3分:中等浸潤;4分:明顯浸潤;5分:嚴重浸潤。

免疫組化檢測用SABC(鏈霉親和素生物素酶復合物)法,HIF-1α和VEGF陽性滑膜細胞均呈顆粒狀棕黃色或棕褐色。采用真彩色圖像分析系統對HIF-1α和VEGF表達強度進行定量分析。方法[4]如下:每張切片隨機選取5個視野(×400),系統自動測量出陽性染色部位的積分光密度(IOD),5個視野的平均IOD值代表該切片HIF-1α和VEGF的表達情況。

2 結果

2.1 實驗動物入選情況 造模組大鼠共有11只大鼠造模成功,其間死亡1只。最后造模組入選大鼠10只。

2.2 大鼠滑膜病理學改變及病理學評分 見圖1、2。正常大鼠滑膜襯里層有1～2層滑膜細胞組成,且部分不連續?；ひr里層下層為由脂肪細胞、少量成纖維細胞、巨噬細胞和少量血管組成的結締組織?；そM織無炎性細胞浸潤,無纖維組織增生。而AA大鼠可見滑膜組織中等量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤,平均病理積分3.8±0.45,滑膜襯里層增生達4～6層(表1)。

圖1 正常對照組(HE)(×400)Fig.1 The normal synovium(HE)(×400)

2.3 滑膜組織HIF-1和VEGF的表達 見圖3～6。正常對照組大鼠滑膜組織均有少量HIF-1和VEGF的表達。而造模組滑膜組織HIF-1和VEGF均明顯高于正常對照組(P＜0.01)(表2)。

圖2 模型對照組(HE)(×400)Fig.2 The hyperplastic synovium(HE)(×400)

表1 大鼠膝關節滑膜病理積分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

表1 大鼠膝關節滑膜病理積分(±s)Tab.1 Histopathological integration of synovial membrane(±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n 28 d Control 10 0 AA 10 3.8±0.45

圖3 正常對照組VEGF表達(×400)Fig.3 The expression of VEGF of synoviumin normal rat(×400)

圖4 模型對照組VEGF表達(×400)Fig.4 The expression of VEGF of synoviumin AArat(×400)

圖5 正常對照組HIF-1α表達(×400)Fig.5 The expression of HIF-1αof synovium in normal rat(×400)

圖6 模型對照組HIF-1α表達(×400)Fig.6 The expression of HIF-1αof synovium in AA rat(×400)

表2 滑膜組織HIF-1α和 VEGF的積分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

表2 滑膜組織HIF-1α和 VEGF的積分光密度值(±s)Tab.2 IOD of HIF-1αand VEGF of synovium( ±s)

Note:P＜0.01 compared with control group.

Groups n HIF-1α VEGF Control 10 176.74±50.95 192.71±14.22 AA 10 1 002.75±238.44 1 030.30±247.80

2.4 滑膜病理學評分與HIF-1和VEGF表達的相關性 滑膜組織病理積分與HIF-1α、VEGF的IOD值均成直線正相關,分別為r=0.810(P＜0.01),r=0.778(P＜0.01)?；そM織HIF-1α和VEGF之間的IOD值成直線正相關,r=0.890(P＜0.01)。

3 討論

HIF-1是促進血管新生的關鍵因子,可能在RA發病機制中起重要作用。HIF是一種調節細胞氧平衡和缺氧反應基因表達的核轉錄因子,HIF-1α更為重要。HIF-1是缺氧狀態下血管生成的核心調控因子,通過調控其他因子的表達,直接參與血管生成[5],而VEFG是血管生成初期關鍵性生長因子。HIF-1對VEFG調控表現為:①HIF-1能夠啟動VEGF轉錄;②缺氧時VEGF mRNA穩定性增加;③HIF-1還可以上調VEGFR1轉錄,加強VEGF生物學效應[6]。血管生成效應主要是VEGF激活VEGFR2的結果。VEGF表達升高的主要原因是HIF-1α表達增加,通過與VEGF啟動基因內的缺氧反應元件(HRE)結合,使VEGF表達升高[1]。VEGF也是導致滑膜炎癥和血管生成的主要因子。VEGF的生理功能[7]:①促進血管內皮細胞有絲分裂和血管新生;②增強血管通透性,促進血管內物質滲出,從而促進慢性炎癥形成和發展。本實驗發現正常滑膜組織也少量表達 HIF-1α和VEFG,提示 HIF-1α和 VEFG 在維持滑膜正常功能中起一定作用。而AA大鼠滑膜襯里層增生達4～6層,可見滑膜組織中等量淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤。HIF-1α和VEFG的表達明顯高于正常對照組,且與病理學評分成直線正相關,表明過度表達的HIF-1α和VEFG可能是滑膜炎癥發生和進展過程中的重要的細胞因子,在滑膜血管翳的形成和滑膜增生中具有重要作用。HIF-1α和VEFG的表達呈直線正相關,提示二者在滑膜血管的增生中可互相影響共同促進滑膜血管翳的形成。細胞因子在RA發病機制中至關重要,是炎癥和損傷的重要遞質,在臨床治療RA能否抑制或拮抗關節滑膜局部HIF-1α和VEFG表達,從而抑制滑膜血管翳增生及骨關節的破壞還有待深入研究,為臨床治療RA提供新思路。

1 Bouis D,Kusumanto Y,Meijer C et al.A review on pro-and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention[J].Pharmacol Res,2006;53:89-103.

2 Paleolog EM,Miotla JM.Rheumatoid arthritis:A target for antiangiogenic therapy?[J].Humana PressInc,2001;8(6):129-149.

3 張 晶,左曉霞,李 通 et al.沙利度胺對大鼠佐劑性關節炎的治療作用及其對炎性細胞因子的影響[J].中華風濕病學雜志,2005;9(11):656-659.

4 Peters C L,Morris C J,Mapp P I et al.The transcription factors hypoxiainducible factor 1αand ets-1 colocalize in the hypoxic synovium of inflamed joints in adjuvant-induced arthritis[J].Arthritis Rheumm,2004;50(1):291-296.

5 Gaber T,Dziurla R,Tripmacher R et al.Hypoxia inducible factor(HIF)in rheumatology:low O2!See what HIF can do![J].Ann Rheum Dis,2005;64:971-980.

6 DistlerK.Hypoxia and angiogenesis in rheumatic diseases[J].Z Rheumatol,2003;62(Suppl2):43-45.

7 Zachary I.VEGF signalling:integration and multi-tasking in endothelial cell biology[J].Biochem Soc Trans,2003;31:1171-1177.