SLE患者外周血T細胞亞群凋亡特點及其相關機制的研究①

王曉樂 邱潮林 吳秀梅 季曉輝 張冬青 (上海市公利醫院檢驗科,上海 200135)

SLE是一種復雜的自身免疫性疾病,免疫學異常主要表現為T細胞依賴的B細胞功能亢進,大量致病性自身抗體及免疫復合物產生。T細胞亞群凋亡異常是導致SLE T細胞免疫調節紊亂和免疫應答異常的重要機制[1]。已證實,活化的T細胞發生激活誘導的細胞凋亡(Activation-induced cell death,AICD),導致T細胞免疫應答功能紊亂,加速了SLE病理進程。Fas介導的死亡信號受體途徑是T細胞發生AICD的主要途徑,Fas與之在體內的天然配體FasL相結合從而發揮凋亡誘導作用。大量研究表明,IL-10是有效的T細胞和抗原遞呈細胞的抑制因子,SLE患者血清IL-10水平異常升高,很可能促進了異常活化的T細胞高表達FasL,T細胞膜表面FasL通過膜內陷或折疊與自身或鄰近T細胞Fas結合引起了AICD[2]。2005年Wang H等報告:SLE患者PBMCs中CD3+、CD4+、CD8+T細胞亞群凋亡均明顯增加;體外SLE患者血清可誘導T細胞亞群凋亡增多;SLE患者PBMCs培養上清中sFas、sFasL水平升高;細胞內Fas mRNA的表達水平升高[3]。本研究探討了不同病程階段SLE患者T細胞亞群發生凋亡的特點,以及 IL-10與T細胞亞群凋亡之間的聯系,試圖更深入地闡明SLE T細胞的凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 對象 選取2005年4月至2008年4月在南京醫科大學附屬常州二院風濕免疫科就診的SLE患者,共45例,均符合美國風濕病協會(ARA)1997年修訂的SLE診斷標準[4],活動性判定以多倫多大學的SLE活動指數(SLEDAI)為標準[5]。其中的35例SLE患者按疾病活動性分成兩組,包括:高活動性患者(SLEDAI≥10)25例,男性 2例、女性 23例,年齡19～58歲、平均(36±9)歲;低/非活動性患者(SLEDAI＜10)10例,包括男性2例、女性 8例,年齡17～53歲、平均(38±11)歲。35例SLE患者臨床檢驗改變特點見表1。另外10例SLE患者進行跟蹤試驗:其中初診患者5例,均為女性,年齡19～68歲、平均(39±21.51)歲;SLE活動期(SLEDAI≥10)患者5例,其中 1例為男性,年齡 18～57歲、平均(33.8±15.16)歲。從以上45例SLE患者中選取10例血清IL-10水平升高(IL-10≥20)的患者進行體外抗體中和實驗,均為女性,年齡22～46歲、平均(34.70±8.92)歲。20例正常人對照選自來我院健康體檢合格者,包括男性3例、女17例,年齡23～53歲、平均(32±7)歲。

1.2 主要試劑 血清抗ds-DNA抗體放射免疫分析試劑盒為北京北方生物技術研究所產品。血清IgG、C3、C4檢測試劑為芬蘭Orion診斷公司產品。人血清IL-10 ELISA檢測試劑盒、熒光標記抗體包括抗CD4-FITC、抗CD8-PE、抗 CD3-PerCP以及 PE-Cy5標記的CD3、CD4、CD8單抗及其同型對照單抗、FITC標記的Fas單抗及小鼠IgG1同型對照單抗、PE標記的FasL單抗及小鼠IgG1同型對照單抗、Annexin V-FITC凋亡試劑盒等均為上海晶美生物工程有限公司產品。純化的IgG1類鼠抗人IL-10單克隆抗體及其同型對照為Biolegend公司產品。純化的IgG1類鼠抗人FasL單克隆抗體及其同型對照為Biolegend公司產品。RMPI Medium 1640,pH7.4,不含血清,為Gibco公司產品。胎牛血清(FCS)為Biosource公司產品。淋巴細胞分離液為上海恒信化學試劑有限公司提供產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集與處理 無菌條件下取SLE患者或正常對照者外周血10 ml,2 ml置于干燥管,收集血清,保存于-20℃冰箱中,用于血清IL-10的檢測,檢測于凍存后一周內完成;另外8 ml外周肝素鈉抗凝,其中2 ml用于相關流式檢測,6 ml用于外周血單個核細胞(PBMCs)的分離培養。需注意:抗凝血應及時放入25℃水浴箱中,且所有檢測、處理應在4小時內完成。

1.3.2 T細胞亞群百分比例的檢測 取SLE患者或正常對照者肝素抗凝血1 ml,按照CD4/CD8/CD3熒光標記單抗試劑盒的要求操作,流式細胞儀FACs Calibur由美國BD公司生產,以FSC/SCC二維散射光圖確定淋巴細胞群體,檢測10 000個淋巴細胞,每例樣本設一組同型對照,利用功能軟件得到CD3+、CD4+、CD8+細胞亞群占總細胞數的百分比,并得到CD4+/CD8+比值。

表1 35例SLE患者主要臨床檢驗指標的變化特點(±s)Tab.1 The results of clinical examinations in 35 SLE patients(±s)

表1 35例SLE患者主要臨床檢驗指標的變化特點(±s)Tab.1 The results of clinical examinations in 35 SLE patients(±s)

Note:Compared with low-level active SLE group,1)P＜0.05;2)P＜0.01.

Groups n SLEDAI ds-DNA antibody binding rate(%) ESR(mm/h) WBC(109L-1) IgG(g/L) C3(g/L) C4(g/L)Hyperactive SLE 25 12.28±1.97 37.27±20.711) 47.60±17.492) 3.83±0.912) 18.66±4.872) 0.61±0.302) 0.13±0.082)Low-level active SLE 10 6.10±1.91 18.39±16.42 28.80±10.35 4.96±0.76 12.20±2.58 1.08±0.43 0.25±0.10

1.3.3 T細胞亞群早期凋亡的檢測 PBMCs常規培養48小時后,用3 ml PBS洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,按Annexin V凋亡試劑盒操作要求,對CD3+、CD4+、CD8+T細胞進行Annexin V凋亡檢測,在功能軟件上對AV+PI-的T細胞亞群作早期凋亡分析,每例樣本同時設立一組同型對照。

1.3.4 T細胞亞群Fas、FasL表達率的檢測 取SLE患者或正常對照者肝素抗凝血1 ml,按照試劑盒的操作要求,分別檢測CD3+、CD4+、CD8+T細胞Fas+/FasL+的表達率,每例樣本設一組同型對照。

1.3.5 SLE患者PBMCs常規培養中加入抗IL-10單抗后T細胞亞群Fas/FasL表達及早期凋亡的檢測

1.3.5.1 SLE患者PBMCs常規培養中加入抗IL-10單抗 按照PBMCs常規培養規程操作,24孔培養板上每孔PBMCs細胞懸液中加入3.0 μ l抗 IL-10單抗[6],置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養箱中培養48小時。

1.3.5.2 PBMCs 48小時培養后的處理與檢測 用1 ml PBS稀釋成PBMCs細胞懸液,平均分裝于2支玻璃管中。一管中加入3 ml PBS洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用PBS將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于T細胞亞群Fas、FasL表達率的檢測,步驟詳見1.3.4;另一管中加入2 ml結合緩沖液洗滌一遍,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用結合緩沖液將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于流式T細胞亞群凋亡的檢測,步驟詳見1.3.3。

1.3.6 SLE患者PBMCs常規培養中加入抗FasL單抗后T細胞亞群凋亡的檢測

1.3.6.1 SLE患者PBMCs常規培養中加入抗FasL單抗 按照PBMCs常規培養規程操作,24孔培養板上每孔PBMCs細胞懸液中加入2.0 μ l抗FasL單抗[7],置于37℃、5%CO2的二氧化碳培養箱中培養48小時。

1.3.6.2 PBMCs 48小時培養后的處理與檢測 用2 ml結合緩沖液洗滌PBMCs,1 500 r/min離心15分鐘后棄上清,再用結合緩沖液將PBMCs稀釋至5×105ml-1的濃度,用于流式T細胞亞群凋亡的檢測,步驟詳見1.3.3。

1.3.7 血清IL-10檢測 取SLE患者或正常對照者外周血血清,按試劑盒說明書操作步驟,ABC-ELISA法檢測血清中IL-10水平。

1.3.8 兩組SLE患者的跟蹤實驗 跟蹤實驗第一組:5例SLE初診患者,跟蹤其初發住院階段和治療兩個月后明顯好轉(退熱,蛋白尿減輕,皮膚、關節癥狀緩解,SLEDAI指數下降6分以上)階段;跟蹤實驗第二組:5例SLE高活動期患者,跟蹤其活動階段(SLEDAI≥10)和一年后活動性明顯降低(SLEDAI＜10)的穩定階段。

①血清IL-10水平檢測操作步驟詳見1.3.7。②T細胞亞群Fas、FasL表達率的檢測操作步驟詳見1.3.4。③每例患者每個階段T細胞亞群早期凋亡的檢測操作步驟詳見1.3.3。

1.4 統計學分析 采用SPSS12.0統計分析軟件分析各組數據,符合正態分布使用t檢驗,不符合正態分布使用秩和檢驗,各組之間指標比較使用兩個獨立樣本檢驗,相關分析使用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 SLE患者外周血T細胞亞群的凋亡異常增多

SLE患者外周血T細胞亞群凋亡比正常人明顯增多(P＜0.05),以CD4+亞群更為顯著,結果見表2、圖1。

T細胞亞群的凋亡與SLE病情活動性相關,以CD4+亞群更為顯著:CD4+T細胞的凋亡在高活動性組顯著高于低/非活動性組(P＜0.05),且與SLEDAI呈正相關性(r=0.45,P ＜0.05)。T細胞亞群凋亡的不均一性導致T細胞亞群中CD4+T細胞比例下降,CD4+/CD8+的比值下降(P＜0.01),且高活動性SLE組比低/非活動性組更顯著(P＜0.05),結果見圖2。

表2 SLE患者外周血T細胞及其亞群凋亡的改變(±s)Tab.2 The apoptosis of T lymphocyte subsets in SLE patients(±s)

表2 SLE患者外周血T細胞及其亞群凋亡的改變(±s)Tab.2 The apoptosis of T lymphocyte subsets in SLE patients(±s)

Note:Compared with nomal controls group,1)P＜0.05;2)P＜0.01;Compared with low-level active SLE group,3)P＜0.05.

Groups n CD3+AV+PI- CD4+AV+PI- CD8+AV+PINormal controls 20 15.73±8.02 11.25±5.13 13.24±7.11 SLE patients 35 23.44±11.491) 16.88±8.771) 16.69±9.001)Hyperactive SLE 25 28.52±14.112) 21.89±12.642)3) 20.27±13.911)Low-level active SLE 10 20.87±9.79 12.08±5.91 13.98±7.89

2.2 SLE患者T細胞亞群膜表面Fas/FasL的表達率異常增高 SLE患者外周血T細胞膜表面Fas的表達率無論是在高活動性組或低/非活動組均明顯高于正常人(P＜0.01);FasL的表達率亦高于正常人,但主要表現在高活動組(P＜0.01)。這其中,以CD4+T細胞亞群的Fas表達率增高最為顯著,尤其是在高活動性組中,結果見表3。

SLE患者外周血T細胞膜表面Fas/FasL表達率的異常增高與SLE病情活動性相關,主要表現在高活動性組中:Fas表達率與SLEDAI正相關(r=0.46,P＜0.05);FasL表達率與SLEDAI亦正相關(r=0.49,P＜0.05)。

2.3 SLE患者外周血T細胞高表達Fas/FasL與T細胞凋亡增多正相關 高活動性SLE患者CD4+T細胞的凋亡增高與其高表達Fas(r=0.45,P＜0.05)、FasL(r=0.43,P＜0.05)和CD8+T細胞高表達FasL(r=0.42,P＜0.05)呈現正相關性;而CD8+T細胞的凋亡與其自身高表達Fas(r=0.48,P＜0.05)和FasL(r=0.49,P＜0.05)呈正相關。

將抗FasL單抗加入SLE患者PBMCs常規培養中后,SLE患者T細胞各亞群凋亡均明顯減少(P＜0.01),并以CD4+T細胞凋亡減少最為顯著,其凋亡平均減少率超過50%,明顯高于CD8+T細胞,且兩組差異有統計學意義(P＜0.01),結果見圖3。

2.4 SLE患者血清中異常增高的IL-10水平與T細胞凋亡密切相關 SLE患者血清IL-10水平較正常人顯著升高(P＜0.01),高活動性SLE患者與低/非活動性患者比較更為明顯(P＜0.01),結果見表4。

圖1 SLE患者T細胞CD4+/CD8+亞群凋亡FACS結果Fig.1 FACS results of the apoptosis of T lymphocyte subsets(CD4+/CD8+)in SLE patients

表3 SLE患者T細胞CD4+和CD8+亞群 Fas/FasL的表達率(±s,%)Tab.3 The positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients(±s,%)

表3 SLE患者T細胞CD4+和CD8+亞群 Fas/FasL的表達率(±s,%)Tab.3 The positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients(±s,%)

Note:Compared with nomal controls group,1)P＜0.05,2)P＜0.01;Compared with low-level active SLE group,3)P＜0.05.

Groups n Fas+FasL+CD4+ CD8+CD4+ CD8+Nomal controls 20 11.56±4.78 7.64±3.42 0.27±0.16 0.45±0.39 SLE patients 35 16.11±7.491) 10.95±7.37 1.10±1.042) 0.92±0.642)Hyperactive SLE 25 16.54±8.151) 11.57±7.38 1.26±0.842)3) 0.97±0.672)Low-level active SLE 10 15.65±5.43 10.77±3.86 0.66±0.511) 0.72±0.531)

比較SLE患者血清IL-10水平與6個SLE主要臨床檢驗指標(血沉 、IgG 、C3、C4、WBC 、抗 ds-DNA 抗體)之間的相關性,結果顯示:抗ds-DNA抗體與血清IL-10水平間的相關性最顯著(r=0.83,P＜0.01);高活動組IL-10水平與IgG水平也呈現一定的正相關性(r=0.41,P＜0.05)。SLE高活動性組中,血清IL-10水平異常升高與SLEDAI具有一定的相關性(r=0.43,P＜0.05);與CD4+T細胞亞群的凋亡增加正相關(r=0.54,P＜0.05);與 T細胞亞群CD4+/CD8+比值下降負相關(r=-0.43,P＜0.05);與SLE T細胞亞群高表達Fas/FasL密切相關,如表5所示。

圖2 SLE患者外周血T淋巴細胞及其亞群的百分含量Fig.2 The percentages of T lymphocyte subsets in SLE patients

圖3 10例高活動期SLE患者PBMCs培養中加入抗FasL抗體T細胞亞群凋亡的改變Fig.3 The apoptosis of T lymphocyte subsets in 10 hyperactive SLE patients in the vitro inhibition experiments

SLE患者PBMCs培養時加入抗IL-10抗體后,T細胞亞群Fas/FasL的表達率減少(P＜0.05),CD4+T細胞與CD8+T細胞相比較,雖然前者Fas/FasL表達的平均減少率高于后者,但統計學上兩亞群無差異(P＞0.05)。加入抗IL-10抗體后,患者T細胞亞群凋亡下降(P＜0.05),CD4+T細胞平均凋亡減少率略高于CD8+T細胞,但差異尚無統計學意義(P＞0.05);CD4+/CD8+比例倒置得到一定改善(P＞0.05)。

2.5 SLE患者經治療病情好轉、穩定時伴有IL-10水平下降、Fas/FasL表達減少和T細胞凋亡減少 5例SLE初診患者血清IL-10水平隨著病情好轉逐漸減少(P＜0.05);T細胞亞群Fas/FasL的表達率也隨著病情好轉逐漸下降,其中Fas表達率減少以CD4+T細胞更明顯(P＜0.05),結果見表6;T細胞亞群細胞凋亡亦顯下降趨勢,可能由于病例數較少,下降尚無統計學意義(P＞0.05)。

表4 SLE患者血清 IL-10水平(±s,pg/ml)Tab.4 The level of serum IL-10 in SLE patients(±s,pg/ml)

表4 SLE患者血清 IL-10水平(±s,pg/ml)Tab.4 The level of serum IL-10 in SLE patients(±s,pg/ml)

Note:Compared with normal controls group,1)P＜0.01;Compared with lowlevel active SLE group,2)P＜0.01.

Groups n IL-10 Normal controls 20 12.80±4.24 SLE patients 35 68.90±34.721)Hyperactive SLE 25 81.26±31.421)2)Low-level active SLE 10 33.38±11.841)

表5 35例 SLE患者血清IL-10水平與 T細胞亞群Fas/FasL表達率的相關性Tab.5 The correlations between serum IL-10 level and the positive expression rates of Fas/FasL on T lymphocyte subsets in SLE patients

表6 5例 SLE初診患者經2個月治療病情好轉時IL-10水平(±s,pg/ml)及T細胞亞群Fas/FasL表達率(±s,%)的變化Tab.6 The level of serum IL-10(±s,pg/ml)and the positive expression rates of Fas/FasL(±s,%)on T lymphocyte subsets in a 2-month tracking experiment of first-visit SLE patients

Note:Compared with First-visit group,1)P＜0.05.

Clinical course n IL-10CD3+T cells CD4+T cells CD8+T cells Fas FasL Fas FasL Fas FasL First-visit 5 140.60±49.39 50.21±11.76 3.19±1.10 25.73±3.06 1.61±0.60 23.15±5.23 1.57±0.47 Improving phase 5 87.20±31.041)42.82±6.85 2.47±0.65 21.67±5.161) 1.01±0.34 20.08±5.85 1.39±0.54

圖4 SLE患者病情穩定階段CD4+T細胞Fas+表達及凋亡的流式圖Fig.4 The apoptosis and Fas+expression rate of CD4+T lymphocytes in a stable SLE patient

5例SLE高活動期患者跟蹤一年后隨著病情穩定血清IL-10水平顯著下降(P＜0.01);T細胞亞群Fas/FasL表達率呈明顯下降趨勢(P＜0.05),尤其是CD4+T細胞Fas表達明顯下降(P＜0.01);CD4+T細胞亞群凋亡的減少亦尤為顯著(P＜0.05),結果如圖4所示。

3 討論

SLE是T細胞介導的B細胞疾病,自身反應性T細胞異常活化、機體的免疫耐受和免疫平衡被打破是SLE的主要發病機制。近年來T細胞凋亡在SLE的病理進程中的作用受到越來越多人的關注。SLE異常活化的T細胞發生細胞凋亡在某種程度上降低了自身免疫應答反應,對病情緩解有一定的積極作用,但另一方面凋亡會產生能促使SLE自身免疫應答的免疫物質,凋亡物質寡聚核苷酸樣DNA與抗體形成的一系列免疫復合物沉積在組織中將導致組織損傷[8,9]。深入研究SLE T細胞凋亡機制及其與SLE疾病進程的關系,以及相關調控因子的作用,將有助于深入認識SLE的病程發展機制。

SLE T細胞凋亡的機制非常復雜,主要是通過激活誘導的細胞凋亡(AICD)途徑。Fas是介導T細胞發生AICD的主要受體分子,活化的T細胞膜表面Fas表達升高,與其配體FasL結合后,Fas的死亡域(DD)與胞漿內接頭蛋白FADD(Fas相關死亡結構域)的DD發生同型作用,FADD又通過其死亡效應域DED募集含DED的caspase 8,caspase 8的激活引起Caspase家族的一系列酶聯反應,引起DNA降解和鏡下可見的細胞及細胞核的凋亡形態學改變[10]。目前,對于SLE患者T淋巴細胞凋亡的特點,國內外文獻報道不盡相同[11-13]。SLE T淋巴細胞的凋亡很可能與SLE病情活動度相關,且不同亞群的凋亡狀態很可能不同。

通過實驗,我們發現SLE患者外周血T細胞凋亡的3個主要特點:CD4+亞群T細胞的凋亡異常顯著,且與SLE疾病活動性正相關;T細胞亞群膜表面表達Fas/FasL異常增高,且與SLE病情活動性相關;FasL是最重要的死亡因子,SLE異常活化的CD4+、CD8+T細胞高表達FasL是SLE T細胞發生AICD的關鍵。Nakajima等曾應用FasL單抗治療NZB/WF1小鼠,發現狼瘡性腎炎的進展得到明顯抑制[14,15]。本實驗結果也顯示,體外SLE患者PBMCs的培養中加入FasL抗體可顯著抑制T細胞亞群凋亡。在機體的免疫應答中,活化的T細胞發生AICD是重要的負反饋調節機制之一:Fas/FasL表達率的增加可能是SLE T淋巴細胞異常活化后的一種結果,而這直接導致T細胞發生AICD。

實驗同時發現,SLE患者血清IL-10水平顯著升高,高水平的IL-10不僅與抗ds-DNA自身抗體增加密切相關,還與T細胞亞群異常凋亡、CD4+/CD8+T細胞亞群平衡失調密切相關。Llorente等曾應用IL-10中和單抗治療SLE動物模型,取得了一定的療效[16,17]。本實驗結果顯示,體外SLE患者PBMCs的培養中加入IL-10抗體后,CD4+T細胞亞群的Fas/FasL高表達及凋亡異常明顯抑制,CD4+/CD8+比例倒置狀況得到改善。IL-10作為體內重要的免疫調節抑制因子,參與刺激自身抗體的產生和抑制細胞免疫應答。

IL-10對SLE患者T淋巴細胞凋亡的調節作用具體體現在:SLE患者高水平的IL-10參與誘導T細胞亞群高表達Fas/FasL,尤其是CD4+和CD8+T細胞亞群高表達FasL,使Fas表達顯著增高的CD4+T細胞亞群發生AICD,最終導致CD4+T細胞比例下降、CD4+/CD8+比值降低、T細胞免疫功能缺陷,促進了SLE疾病的發展。這在跟蹤實驗中也得到了進一步證明,SLE患者經治療病情好轉、穩定時伴有IL-10水平下降,同時T細胞亞群表達Fas/FasL明顯下降,T細胞凋亡也逐漸減少,這些變化在CD4+T細胞亞群中體現得最為明顯。

綜上所述,我們可以初步認為:SLE的發生、發展及緩解與T細胞亞群的免疫平衡密切相關。在免疫抑制因子IL-10的調節下,SLE異常活化的T淋巴細胞發生了以Fas/FasL為主要死亡途徑的AICD,這有助于SLE患者細胞免疫功能的恢復。誠然,T細胞的凋亡機制非常復雜,涉及Fas/FasL為代表的外源性途徑和Bcl-2為代表的線粒體途徑,還涉及一系列的調節基因和影響因子。SLE活化的T細胞有無其他途徑的凋亡機制,IL-10是否還以其他途徑誘導T細胞凋亡,我們將在另文發表。

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