多柔比星心臟毒性機制研究進展

孫習鵬，萬麗麗，郭澄（上海交通大學附屬第六人民醫院藥劑科，上海市 200233）

多柔比星（Doxorubicin，DOX，又稱阿霉素）屬蒽環類抗生素[1]，是目前最有效的抗腫瘤藥物之一，但嚴重的劑量依賴性心臟毒性限制了其臨床應用。首次使用DOX后就可能誘導心臟毒性的發生，開始沒有明顯的臨床癥狀，持續使用可以導致充血性心力衰竭，故臨床推薦累積劑量不大于450 mg·m－2。盡管臨床應用多年，但DOX的抗腫瘤機制仍存在爭論，其心臟毒性產生機制亦不清楚。然而目前達成的共識是，DOX心臟毒性產生機制不同于其抗腫瘤機制，因此在不降低抗腫瘤活性的前提下有可能達到降低心臟毒性的目的。當前普遍認為，活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和脂質過氧化反映出的氧化應激的增加以及抗氧化劑和巰基水平降低反映出的抗氧化能力減弱，在DOX誘導心臟毒性產生的過程中起重要作用，而細胞凋亡、特異性基因表達異常、誘導p53表達、鈣超載等在DOX心臟毒性產生中也起著重要的作用。DOX心臟毒性產生的物質基礎的研究也逐漸得到重視，大部分研究者傾向于認為其代謝產物阿霉素醇（DOXol）在心臟毒性產生中具有一定作用。本文將從以上幾個方面闡述DOX心臟毒性機制的最新研究進展，并闡明這些因素之間的關聯性。

1 心臟特異性分布

靜脈注射后，DOX迅速分布于心、腎、肝、脾、肺等組織中，心臟組織的消除半衰期明顯長于其他組織。Goormaghtigh等研究蒽環類抗生素對類膜磷脂（脂質單層、脂質體）和中性磷脂（卵磷脂、蛋磷脂）親和力時發現，蒽環類抗生素對心肌磷脂有高親和力[1]。而心臟線粒體內膜的心肌磷脂含量高，DOX可以特異性分布在心臟中。但也有研究認為，與肝、腎等其他組織相比，DOX及其代謝產物在心臟沒有明顯的分布。盡管在心臟特異性分布的認識上存在分歧，但體外分離的線粒體可以有效地蓄積DOX，小鼠心臟再灌注實驗也證實DOX在細胞核和線粒體內有特異蓄積[2]。DOX的心臟分布特性與年齡有關，與低齡大鼠相比，高齡大鼠心臟中DOX濃度明顯升高。DOX大量吸收進入心臟是心臟毒性發生的重要因素，也是制訂降低毒性治療方案的基礎。比如其以脂質體包合后，DOX在心臟中的分布減少、心臟毒性降低但抗腫瘤效果不受影響。DOX在心臟組織的特異性分布是不是其毒性產生原因還需要進一步研究。此外，與其他組織相比，心臟僅僅含有少量的過氧化氫酶和超氧化物岐化酶（SOD）等抗氧化酶，這種弱的抗氧化能力也加劇了DOX心臟毒性。

2 氧化應激

2.1 ROS的生成

ROS是體內一類來源于氧的自由基和非自由基分子，包括超氧陰離子（O－2）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）以及一氧化氮（NO）等。DOX醌基在還原型輔酶Ⅱ（NADPH）依賴性還原酶、細胞色素P450酶和黃嘌呤氧化酶等的作用下，被還原為相應的半醌自由基，半醌自由基和氧氣作用又生成醌基，DOX衍生的醌-半醌氧化還原循環不斷地產生ROS。此外，ROS也可以產生于DOX與鐵離子反應的非酶機制。Fe3+通過Haber-Weiss反應生成羥基自由基，或與DOX發生氧化還原反應，Fe3+接受一個電子形成Fe2+-DOX自由基復合物。這種Fe2+-DOX復合物可以還原氧氣為過氧化氫和其它活性氧基團。電子自旋共振光譜直接檢測到DOX生成的ROS，說明氧化應激在心臟毒性產生中的作用。ROS引起的脂質過氧化產物丙二醛含量的升高，間接說明氧化應激在心臟毒性產生中的作用。

2.2 線粒體損傷

線粒體損傷在DOX心臟毒性產生中發揮重要作用。線粒體是DOX的靶目標，其特異性蓄積DOX，DOX在線粒體酶的作用下生成ROS。線粒體內生成的ROS可以滲透進入其產生位點附近的蛋白質、脂質、核酸中，使線粒體發生氧化損傷。

線粒體通透孔（Mitochondrial permeability transition pore，MPTP）是一種很重要的氧化還原敏感型蛋白復合物，氧化應激可以調控MPTP的開放，使大分子通過線粒體膜并降低線粒體膜電位。Solem等長期給予大鼠DOX后發現，DOX誘導心臟線粒體MPTP敏感性增強[3]。MPTP調控細胞色素C及其它凋亡因子釋放進入細胞質，啟動細胞凋亡。Green等用DOX作用于線粒體發現，ROS的生成早于線粒體釋放的細胞色素C誘導的細胞凋亡[4]，說明ROS與線粒體損傷存在因果關系，且線粒體的結構損傷在凋亡過程中發揮著重要作用。早期研究線粒體功能異常時發現，DOX可以增加線粒體非磷酸化氧消耗，減少磷酸化氧消耗，這與DOX氧化還原循環過程消耗氧有關。這也意味著三磷酸腺苷（ATP）合成效率的降低，導致心肌細胞內生物能量代謝失衡，引起心律失常等其他病理變化。

DOX長期心臟毒性可能與線粒體內遺傳基因mtDNA改變有關。mtDNA是線粒體內特有的遺傳基因，可以編碼電子傳遞鏈（ETC）復合物中的13個亞單位。Palmeira等通過單次大劑量給予大鼠DOX，檢測8-羥基脫氧烏苷（8OHdG）-DNA復合物的含量變化，發現DOX誘導的氧化應激很容易破壞mtDNA[5]。Zhou等長期給予大鼠DOX后發現DOX可以引起心肌細胞的氧化應激持續增加，停藥后5周ROS的生成還持續上升，谷胱甘肽（GSH）含量下降。由于5周后體內很難檢測到DOX，所以停藥后氧化應激的持續，可能是由于線粒體內mtDNA損壞引起其表達的蛋白亞單位功能改變所致[6]。

2.3 鐵離子在氧化應激中的作用

如前所述，鐵離子可以與DOX反應生成ROS，增加氧化應激。同時，ROS又會引起鐵調控蛋白（IRP）的紊亂和鐵蛋白功能異常，引起鐵離子內環境失衡。鐵離子螯合劑對鐵離子的高親和力，可以抑制鐵離子與DOX結合，減少ROS生成。右雷佐生（ICRF-187）是一種類似乙二胺四乙酸（EDTA）的二價螯合物，臨床治療晚期乳腺癌婦女時發現右雷佐生可以降低DOX心臟毒性，且幾乎不降低其抗腫瘤活性。雖然已經得到FDA批準上市，但是鐵離子螯合劑的作用機制仍不清楚。

IRP-1是一個重要的細胞鐵離子代謝調控因子，最近發現IRP-1與氧化應激之間存在聯系。鐵離子應答區有高含量的鐵傳遞蛋白受體，但只合成少量的鐵蛋白，細胞外過氧化氫或細胞內ROS生成因子誘導IRP-1與鐵應答區結合，加重細胞氧化應激。這個結果有助于闡明鐵敏感元件/IRP-1系統在DOX心臟毒性產生中的作用。

盡管鐵離子在DOX心臟毒性中發揮重要作用，但Kaiserova等通過對比幾種鐵離子螯合劑如右雷佐生、去鐵敏等對降低DOX和過氧化氫誘導的氧化應激作用時發現，螯合鐵離子可以降低DOX誘導產生的氧化應激，但并不降低其心臟毒性。說明鐵離子螯合劑除了清除鐵離子外，還發揮著其他作用[7]。van Acker等發現黃酮類化合物monoHER可以降低DOX心臟毒性，除了其鐵離子螯合作用外，抗氧化及抗炎特性也發揮了重要作用[8]。鐵離子除了在氧化應激中起作用外，可能還參與了其他一些重要的生理功能，但具體作用環節尚不清楚。

2.4 一氧化氮（NO）在氧化應激中的作用

正常生理條件下，NO是一種重要的血管擴張劑和神經遞質。同時，NO也是一種自由基分子，過量的NO通過調控其它因子直接或間接引起組織損傷，如大量的NO可引起心肌功能酶如肌原纖維肌酐激酶等硝化失活，致使心肌受損；激活鳥苷酸環化酶，使細胞內的NO與O－2反應生成活性更強的過氧化亞硝酸自由基（OONO·），增加氧化應激等。

DOX可以誘導內皮一氧化氮合酶（eNOS）的轉錄，增加內皮細胞相關表達蛋白的活性。在eNOS還原酶區域內DOX直接被單電子還原，合成超氧化物。事實上，DOX被eNOS代謝的Km比細胞色素P450還原酶和NADH脫氫酶低10到100倍。所以，其主要通過與O－2反應生成活性更強的OONO·自由基，而間接地加重DOX誘導的氧化應激。抗氧化劑可以降低DOX引起的eNOS上調，減少細胞凋亡，從而降低心臟毒性。eNOS通過調控ROS介導內皮細胞凋亡在DOX心臟毒性中發揮作用。也有文獻報道，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在合成NO方面起重要作用。DOX可誘導體內iNOS表達，iNOS的選擇性抑制劑氨基胍可以有效緩解DOX引起的心肌損傷，延長小鼠生存時間[9]。Qin等的研究也得到類似的結果，DOX引起血漿中NOS總活性的增強，并伴隨著肝臟和腎臟中的iNOS高表達。iNOS活性增強促進NO的合成，引起全身的氧化應激[10]。

總之，多項研究表明氧化應激的增加和抗氧化能力的不足在DOX心臟毒性產生中發揮著重要作用。但是氧化應激在DOX心臟毒性產生中的作用也存在爭議，如維生素E或N-半胱氨酸等抗氧化劑不僅對其無抑制作用，甚至不能延緩心臟毒性發病過程。抗氧化劑、自由基清除劑和鐵離子螯合劑在降低DOX心臟毒性產生中效果存在差異。這些結果說明氧化應激的增加可能僅僅是心臟毒性產生的一個重要環節，降低氧化應激后，其他因素也可能引起心臟毒性。

3 凋亡

DOX誘導腫瘤細胞凋亡是有益的，但其對心肌和血管細胞的促凋亡作用可能與心臟毒性有關，因為較輕的心肌細胞凋亡都足以引起心肌病。DOX通過內在的（線粒體介導）和外在的（Fas/Fas L介導）2種凋亡途徑在細胞內和體內模型中誘導凋亡的發生，然而還不清楚這2種途徑是相互獨立還是存在關聯性。Fas L中和抗體阻斷Fas/Fas L凋亡途徑后可以抑制DOX心肌細胞毒性[11]。與對腫瘤的細胞抑制效應相反，DOX誘導心肌細胞和內皮細胞凋亡可能與氧化應激有關。Bax基因有一個p53結合位點，p53的激活可直接引起Bax基因活化，而超氧化物和過氧化氫可以誘導p53，調控Bax/Bad從細胞質易位到線粒體。另外，氧化應激可以激活ASK1（一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPKKK家族成員），活化的ASK1激活c-Jun氨基端激酶（JNK）和p38促分裂原活化蛋白激酶途徑而引起細胞凋亡，這個過程的機制可能是通過活化的JNK引起14-3-3蛋白磷酸化而使Bax易位到線粒體。線粒體產生的ROS和鈣離子在促進DOX在心肌細胞中激活的2種凋亡途徑中發揮著重要作用。DOX可以刺激鈣/神經鈣蛋白依賴的轉錄因子NFAT活化，ROS和鈣離子在NFAT信號轉導中起作用，而Fas L的表達依賴NFAT信號機制[11]。另外，DOX可以誘導LOX-1的表達，這種受體的表達與凋亡相關，并且氧化應激在LOX-1的表達中發揮著重要作用。

目前，凋亡在DOX心臟毒性發生過程仍存在的爭議主要集中在沒有直接的病理學指標，大多數研究僅僅通過DNA碎片、半胱天冬酶等生化指標來反映細胞凋亡，并且大量的病理檢查也沒能夠在DOX致心臟毒性的患者心臟組織解剖中檢測到心肌凋亡。

4 誘導p53表達

p53基因又稱人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53 kDa的蛋白質，命名為p53，是細胞生長和死亡的一個重要調控因子。研究表明，p53在缺氧、局部缺血和心力衰竭等因素誘導的心肌凋亡中調控信號轉導。而DOX可以誘導p53的表達，表明p53可能在DOX心臟毒性中發揮作用。Liu等發現p53抑制劑Pifithrin-α可以有效抑制DOX引起的心肌細胞凋亡，降低DOX心臟毒性，并且Pifithrin-α不影響p53及其磷酸化形式的體內水平[12]。p53在DOX心臟毒性中的作用在p53基因敲除小鼠模型上得到了證明。Shizukuda等研究發現，p53基因敲除小鼠可以抑制DOX引起的左心室舒張功能降低和心肌細胞凋亡，降低DOX急性心臟毒性；且與正常小鼠相比，心肌中谷胱甘肽和Cu/Zn SOD含量維持正常。這個結果表明，p53在DOX急性心臟毒性和氧化應激的產生中發揮著重要作用[13]。Liu等的研究第1次發現ERK/p53信號轉導途徑在DOX誘導細胞凋亡中起作用。在DOX引起細胞Bcl-2族蛋白改變、線粒體膜能量降低和凋亡等變化之前，ERKs和p53發生磷酸化并易位到細胞核[14]。Zhu等研究發現，DOX通過p53依賴性抑制mTOR信號引起急性心臟功能損傷和心臟重量降低，并且認為，DOX急性心臟毒性的主要原因是心臟重量的降低而不是心肌細胞凋亡[15]。這些研究結果都闡明了p53在DOX心臟毒性中的重要作用，參與氧化應激、細胞凋亡等多個環節。p53可能是降低DOX心臟毒性新的治療靶點。

5 抑制基因表達

DOX下調多種基因表達，這些基因調控心肌特異性蛋白的合成，包括可收縮蛋白（α-輔肌動蛋白、輕鏈和重鏈肌球蛋白、肌鈣蛋白I、索蛋白）、肌漿網蛋白（Ca2+-ATP酶、斯里蘭卡肉桂咸受體RyR2）、線粒體蛋白（鐵-硫蛋白、ADP/ATP易位酶、磷酸果糖激酶）和其它蛋白（肌酸激酶、受磷蛋白、隱鈣素、磷脂酶A2、腦鈉素[BNP]）[16]。心肌收縮功能異常直接與心肌蛋白表達的減少有關，這可以解釋DOX心臟毒性所表現出的心肌纖維損傷等病理學特征。近來研究發現，DOX可以減少GATA-4，GATA-4是心臟發育過程中的一個關鍵調控因子，可以調控心肌肌節蛋白如重鏈肌球蛋白和肌鈣蛋白I的表達。DOX心臟毒性引起細胞外信號調節激酶失活的原因，可能是GATA-4和肌節蛋白表達負向調控的信號逆流。另外，DOX可抑制線粒體mtDNA表達，減少心肌能量供應[5]。DOX還可以抑制肌漿網Ca2+-ATP酶，阻礙收縮后期細胞質內游離Ca2+多價螯合，引起舒張期功能障礙。但還不清楚特異蛋白和轉錄因子的表達改變是否直接由ROS介導。

6 鈣超載

Ca2+是生物體內的重要物質，在維持心肌細胞興奮-收縮偶聯中起重要作用，同時又是多種死亡信號轉導的第二信使。缺血、缺氧等因素可引起鈣平衡系統功能失調，導致細胞內Ca2+濃度異常升高，即鈣超載。鈣超載可導致細胞結構損傷和代謝功能障礙。盡管與氧化應激理論相比受到的關注度低，但很多研究認為DOX介導心肌細胞鈣超載是其心臟毒性產生的原因之一。DOX通過增加肌漿網鈣釋放孔開放頻率、抑制Na+-Ca2+交換、激活L型心肌鈣通道等途徑引起心肌細胞鈣超載。這些途徑還可能引起線粒體鈣超載，導致能量代謝異常，并生成ROS增加氧化應激[17]。

Ca2+與線粒體功能、ROS生成和細胞凋亡之間存在著錯綜復雜的關系。細胞內Ca2+水平升高可以刺激ROS的生成，調控MPTP的開啟，釋放細胞色素C，激活凋亡信號。Kalivendi等發現Ca2+螯合劑可以降低細胞內Ca2+水平、抑制細胞凋亡、減少ROS的產生[18]。Kim在小鼠心臟離體實驗中發現，肌漿網鈣通道阻滯藥可以減少細胞內Ca2+濃度，同時明顯降低ROS的生成且抑制細胞凋亡[17]。Park等發現木蘭科植物厚樸的種子脂肪油提取物可以明顯降低心肌細胞內Ca2+濃度和ROS的生成，減少心肌細胞的凋亡[19]。這些結果表明，ROS的生成是DOX和Ca2+共同作用的結果，Ca2+在心肌細胞凋亡中發揮重要作用。

7 代謝產物介導的心臟毒性

代謝產物在急性和長期心臟毒性中起重要作用。DOX側鏈C13位羰基經過還原生成DOXol。Olson等研究發現[20]，DOXol對心臟舒張期和收縮期功能影響比DOX更大，并且DOXol可抑制內質網膜上的鈣泵、Na+/K+泵和線粒體的F0F1質子泵，但DOXol對腫瘤細胞的殺傷作用遠低于DOX。有研究也認為DOX心臟毒性可能與其特異性代謝物DOXol有關，DOX在NADPH依賴的醛糖、醛基和羰基還原酶的作用下生成DOXol，DOXol可以與鐵離子反應生成ROS，加重氧化應激[21]。

DOXol介導心臟毒性的藥動學證據總結為以下幾方面[22]：（1）長期心臟毒性的發病過程往往伴隨著DOXol在心臟中的蓄積；（2）缺少側鏈羰基還原酶或對C13還原酶親和力低的蒽環類抗生素，產生較輕的心臟毒性；（3）心臟高表達特異性羰基還原酶的動物DOXol的轉化率升高，心臟毒性加重；（4）羰基還原酶基因敲除動物DOXol的生成減少，心臟毒性降低。心臟中DOXol濃度增加的原因可能是DOX在心肌中特異性代謝，而不是肝臟代謝后分布到心臟引起毒性。DOX對心肌磷脂有很高的親和力，在心臟內代謝為DOXol，由于其高極性而很難透過細胞膜，表現為DOXol在心肌細胞中蓄積。關于DOXol在心臟毒性中的作用也存在異議，因為人體大部分組織都含有醛-酮和羰基還原酶，很難理解為什么在心臟中代謝生成DOXol產生毒性而在其他組織不產生毒性。

抑制DOX在心臟中代謝為DOXol可以起到降低心臟毒性的效果，如巴比妥通過抑制醛-酮還原酶，降低大鼠心臟中的DOXol含量，減輕心臟毒性。因此，特異的、安全的醛-酮或羰基還原酶抑制劑可能是一類新的降低DOX心臟毒性的藥物。

8 其他機制

DOX心臟毒性其他機制包括：抑制核酸和蛋白質合成；釋放血管活性胺，如組織胺、兒茶酚胺類、前列腺素等；改變腎上腺素功能和腺苷酸環化酶活性；降低腺苷酸環化酶、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶等活性；心肌電解質失衡；膜黏性和線粒體激酶活性降低等。

9 結語

DOX就像一把雙刃劍，其高效抗腫瘤活性伴隨著嚴重的心臟毒性，臨床應用過程中，主要通過控制其累積劑量、改變給藥途徑或方案、使用抗氧化劑或鐵離子螯合劑等來降低其心臟毒性的發病率，但這些方法的效果并不明顯。從上面的闡述來看，氧化應激、細胞凋亡、相關基因表達異常、鈣超載、毒性代謝產物等許多因素交織成網狀結構，共同在心臟毒性產生過程中發揮作用。僅僅通過單獨抑制一個發病環節，并不能有效降低DOX心臟毒性。因此，今后研究的熱點應該集中在尋找一種能夠發揮多靶點、多重作用，抑制上述多種因素的藥物，從而最大程度地降低DOX的心臟毒性。

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