茶樹基因組DNA測試方法概述

譚和平，沈興中，唐祥凱，葉德萍，王 智

（中國測試技術研究院，四川 成都 610021）

1 引 言

核酸是生物體遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，它控制著蛋白質的合成和有機體細胞的機能，在生物的生長、發育、繁殖、遺傳和變異等生命活動中占有極其重要的地位，針對茶樹遺傳的研究歸根結底還是DNA分子水平，該文就目前茶樹基因組DNA的主要測試方法概述如下。

2 DNA提取純化技術

由于茶樹富含多酚類等次生代謝產物，DNA提取過程中這些產物極易發生氧化，且易與DNA形成復合物，難以獲得高質量的DNA。按目前一般植物常用的DNA提取法提取茶樹DNA，由于沒有進行多酚類化合物的處理使得DNA色素含量較高，難以滿足后續DNA分析的純度要求[1-2]，為此許多文獻對茶樹基因組DNA提取方法進行了探討和改良，主要有CTAB法和SDS法兩種，它們都在防止多酚類物質氧化、去除色素類物質方面進行了改良，主要集中在樣品的研磨過程、抗氧化劑等的選擇方面。

2.1 SDS法

朱旗[1]等將茶樹葉片進行液氮冷凍，然后搗碎成粉末，并嘗試在研磨過程和DNA粗品純化時加入聚乙烯吡咯烷酮PVP去除多酚類化合物以減少色素物質，結果顯示得到了較高質量的DNA，認為PVP能顯著降低色素的含量，提高茶樹DNA的純度。但是有文獻顯示茶樹葉片經過液氮冷凍處理后，使得部分茶樹細胞核破裂，DNA的降解程度較嚴重，影響提取的DNA質量[3]，且在研磨過程中茶樹葉片細胞中的多酚類物質還是會不同程度地發生氧化褐變[4-5]。后來經過改進，普遍采用將茶樹葉片置于研缽中加入液氮研磨的方式，同時添加PVP和一些抗氧化劑如β-巰基乙醇。羅軍武[6]等設計并比較了茶樹基因組DNA提取純化的6種方案，主要研究了PVP、液氮以及抽提液飽和酚/氯仿/異戊醇對茶樹基因組DNA提取質量的影響，經過比較得出研磨過程中加入液氮和PVP，提取和純化過程中各用飽和酚/氯仿/異戊醇提取一次最后得到的DNA質量最好。譚和平[4]等提出在研磨過程中除加入PVP和抗氧化劑β-巰基乙醇之外并協同加入Vc，有助于阻止酚類物質的氧化，其最適宜添加濃度為Vc 0.05g/g鮮樣。

2.2 CTAB法

高峻[7]等采用改進的CTAB微量提取法，提取液中加入β-巰基乙醇，直接將茶樹嫩葉剪碎后進行提取，沒有經過液氮處理，也沒有進行研磨，結果顯示得到了質量較高的DNA。袁長春[8]等提出液氮研磨過程和保溫過程是影響DNA提取質量的關鍵環節，經過改良認為液氮的加入量約為2/5研缽體積，研磨時間約為20～30 min，60℃水浴保溫1.5 h為宜。Mahipal Singh[9]等用CTAB法，提取市場上購回的干茶樣DNA，效果也不錯。黃建安[10]等采用了改良的CTAB和SDS兩類方法都獲得了較高質量的DNA。

2.3 其他方法

梁月榮[11]等采用植物DNA提取試劑盒（Amershan公司產品）提取得到了質量較好的茶樹基因組DNA。但是一般的植物DNA提取試劑盒由于缺乏多酚類化合物的處理步驟，所提取的茶樹基因組DNA顏色黃褐，得率低，純度差，不符合后續的分析要求。

3 DNA濃度定量技術

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法利用核酸在260 nm波長處有最大吸收峰的特點，通過檢測DNA在該波長的吸光值，從而對核酸進行直接定量。但該法并不可靠，要求DNA有相當高的純度，因為核酸樣品中的蛋白質等雜質對核酸的定量有較大影響[12]。

近年來，通過對小分子與DNA相互作用的光譜特性的研究，建立了測定DNA含量的紫外吸收光譜新方法，即通過測定小分子與DNA相互作用的吸收光譜，對DNA進行定量，這類小分子有釕聯吡啶配合物[13]、結晶紫[14]、維多利亞藍[15]、燦爛綠[16]、生物染色劑燦爛甲酚藍[17]和天青Ι[18]等。

3.2 熒光分析法

熒光分析法是利用DNA對小分子熒光探針的熒光強度的改變從而測定DNA的含量，該法操作簡便且靈敏度高，重現性好，取樣量少。按原理又分為熒光淬滅測定法、體系能量轉移測定法、熒光增強測定法[19]等。

3.3 基于PCR的核酸定量方法

基于PCR技術的原理，現主要有以下幾種核酸定量方法，包括終點稀釋法、套式PCR、競爭PCR、PCR產物微孔板雜交法、實時熒光定量PCR法等[20]。其中實時熒光定量PCR法特異性強，靈敏度高，是檢測生物樣品中微量DNA最現成的方法。

該方法整個過程可以實時觀測，其原理是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知DNA模板進行相對定量和絕對定量，按原理又分為TaqMan探針法和SYBR Green I熒光染料法。TaqMan探針法添加了一條5′端帶有熒光基團、3′端帶有淬滅基團的熒光探針，當探針完整時，報告基團受到淬滅基團的制約，不能發出熒光。探針被分解后，5′端的熒光物質便游離出來，發出熒光。所釋放的熒光基團數和PCR擴增產物數是一對一的關系，由此可對模板進行準確定量。該法在原理上更為嚴格，所得數據更為準確，但由于采用熒光淬滅及雙末端標記技術，淬滅難以徹底，本底較高而采用酶外切活性，因此定量時易受酶活性影響。SYBR Green I熒光染料法是SYBR Green I與雙鏈DNA結合后發出熒光，熒光信號強度代表了雙鏈DNA的分子數，通過檢測反應體系中的熒光強度，對DNA進行定量，可在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物量，并且由此來推斷模板最初含量，這種方法成本更為低廉，實驗設計更為簡便。

3.4 電化學分析法

電化學發光分析法是近幾年來興起的一種DNA定量方法，是利用DNA與絡合物作用后生成新的絡合物從而導致絡合物峰電流下降，且峰電流或其減小值在一定范圍內與DNA濃度成線性關系而建立的。原理是對電極施加一定的電壓進行電化學反應，反應的產物之間或與體系中的某種組分進行化學發光，用普通光學手段測量發光光譜和強度，對物質進行定量的一種微量分析強度，從而對物質進行定量的一種微量分析方法，具有靈敏、快速、準確和分析適應性廣等特點的一種技術。

3.5 其他方法

此外，還有其他一些方法，如化學放光分析法、共振瑞利散射法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等。

4 分子標記技術

分子標記技術具有客觀、準確、快速的特點，是繼形態標記、細胞標記和生化標記之后發展起來的一種較為理想的遺傳標記形式，能對不同發育時期的個體、任何組織器官甚至細胞作檢測，數量極多，遍及整個基因組，多態性高，遺傳穩定，不受環境及基因表達與否的限制[21-22]。目前運用于茶樹的分子標記方法主要有 RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等[23]。

4.1 RAPD標記技術

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）即隨機擴增多態DNA技術，是目前運用最普遍的一種分子標記技術。原理是用一系列具有10個左右堿基的單鏈隨機引物，對基因組的DNA全部進行PCR擴增，以檢測多態性。該技術原理簡單，引物設計簡便，用一個引物就可擴增出許多片段，實驗周期短，能在較短的時間篩選大量樣品，成本低，而且不需要同位素，安全性好，適用于自動化操作分析，但它是顯性標記，不能識別雜合子位點，且多態性水平較低，實驗的穩定性和重復性差[24]。一些研究者[4，7，11，25-26]先后利用RAPD技術對茶樹品種的遺傳多樣性、種質資源等方面進行了研究，表明RAPD可以作為茶樹優異種質資源遺傳多態性、系統演化和分子鑒別研究的有效手段之一。

4.2 AFLP標記技術

AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）即擴增片段長度多態性技術。原理是基因組DNA經限制性內切酶酶切后，產生大小不同的片段，用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為模板，用含選擇性堿基的引物對模板DNA進行PCR擴增，以此來檢測多態性。

該技術揭示的多態性高，理論上可產生無限多的AFLP標記，重復性好，但是對DNA模板質量要求高，且操作過程復雜，技術難度大，成本高。近幾年AFLP在茶樹中也有了較多的應用[27-28]。

4.3 SSR標記技術

SSR（Simple Sequence Repeat）即簡單重復序列標記技術。原理根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段。由于核心序列重復數目不同，因而擴增出不同長度的PCR產物，以此檢測DNA多態性。

該技術操作簡單，重復性好，不僅能夠鑒定純合體和雜合體，而且結果更加可靠，但引物具有物種特異性，開發引物需要了解基因組的序列信息。近幾年SSR在茶樹中也有了較多的應用[29-30]。

4.4 ISSR標記技術

ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）即內部簡單重復序列標記技術。原理利用生物基因組常出現的SSR本身設計引物，保證引物與基因組DNA中SSR的5′或3′末端結合，通過PCR反應使位于反向排列、間隔不太大的重復序列間的DNA片段進行擴增。

該技術操作簡單，重復性好，揭示的多態性好，成本低，引物通用性強，不需要預先的DNA測序，可以提供豐富的基因組信息，通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，且具有很好的穩定性。

5 結束語

目前茶樹相關研究中還缺乏分子水平上的測試方法標準，其中茶樹DNA提取是茶樹分子水平研究中最基礎的工作，也是最關鍵的一步，所提DNA質量好壞是后續濃度測定、分子標記成功與否的關鍵，所以盡快建立一套完整的適合茶樹DNA提取、純化流程，可以為后面的茶樹分子水平測試奠定良好基礎。其次分子標記技術在茶樹中的應用尚未成熟，今后應通過方法學原理對分子標記技術進行考察，評價不同標記方法對茶樹基因組的適用性，指導今后茶樹的相關研究。

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