CGRP受體拮抗劑CGRP8-37對顱腦創傷后大鼠保護作用的實驗研究1)

賈志亮,劉躍亭,段虎斌

創傷性腦損傷引起的腦水腫是神經外科需要解決的一大難題。目前的方法都還不能完全克服這個難題。CGRP作為腦內存在的一種強大的擴血管物質,在腦損傷后引起的腦水腫中的具體作用目前研究甚少[1]。本實驗通過免疫組化和PCR技術,動態分析CGRP及其拮抗劑在創傷性腦損傷后腦水腫形成這一病理過程中的作用,為CGRP拮抗劑應用于臨床提供相關依據,同時為治療創傷后腦水腫提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組 雄性Wistar大鼠90只(山西醫科大學動物中心提供),體重250 g～300 g,隨機分為對照組(6只)、創傷組(TBI組,42只)和CGR98-37,606組(LT組,42只)。然后再按照0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h隨即分為7個亞組,創傷組和CGRP8-37組每亞組6只,對照組每亞組1只。

1.2 模型制作 創傷組和CGRP8-37組大鼠所處實驗環境相同,用20%的烏拉坦腹腔注射(1.2 g/kg)麻醉滿意后,將大鼠固定在腦立體定位儀上。制作TBI組模型時沿正中線切開頭皮并剝離骨膜,切口長2 cm,暴露右頂骨,牙科臺式電鉆(寧波醫療器械廠)于冠狀縫后1.5 mm,中線右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗,保持硬腦膜完整,用Feeney法[1]按自由落體致傷原理,通過撞擊裝置(軍事醫學科學院儀器廠),將撞桿頭端置骨窗處,另用擊錘(20 g)沿外周導管從30 cm高處自由落下撞擊撞桿,造成右頂葉腦挫傷,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮。于傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h開顱取腦。CGRP8-37組大鼠造成右頂葉腦挫傷后立即腦室內給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37(30 nmol/kg Sigma公司),然后也于0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h開顱取腦。對照組暴露硬腦膜后不予打擊,直接關顱,縫合頭皮。

1.3 免疫組化和HE染色

1.3.1 組織標本制作 將各組大鼠在相應時間斷頭取腦,在無菌條件下,依腦組織的損傷中心為標準冠狀位,切開大腦。前半部分大腦,立即浸入4℃10%中性甲醛溶液內固定24 h～48 h。后半部分大腦放入-180℃液氮罐中,以備PCR之用。將固定后的腦組織從甲醛溶液內取出,以損傷中心為標準冠狀位依向大腦后緣切(4～5)mm腦切片1個,分別進行脫水、包埋,制成蠟塊。

1.3.2 蘇木精-伊紅(HE)染色 蘇木素染液染核至藍,1%鹽酸酒精分化,1%氨水返藍,0.1%伊紅染液染細胞質,然后脫水、透明、封片。采用M IAS-2000圖像分析系統拍照。

1.3.3 免疫組織化學染色 采用PV-6001二步法免疫組織化學檢測試劑盒(北京中山金橋生物技術有限公司)。用0.01 mo l/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0),高壓熱修復40 s;過氧化氫孵育;加兔抗大鼠CGRP多克隆抗體(Sigma公司產品)4℃過夜,使用效價為1∶5 000。次日加辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育30m in;二氨基聯苯胺(DAB)顯色,顯微鏡下控制顯色時間。采用M IAS-2000圖像分析系統,拍照并測定目標面積、視場面積、目標平均灰度和視場平均灰度,并通過以下公式計算陽性單位[PU=｜G 0-GV｜/(1-AAR)GMAX;PU:陽性單位,G0:目標平均灰度,GV:視場平均灰度,AAR:面積密度比值,GMAX:最大灰度(255)]。

1.4 腦組織CGRPmRNA RT-PCR測定和數據分析 在無菌條件下,從液氮罐中取出腦組織,按照對照組、TBI和CGRP8-37組相應的時間點行RT-PCR分析,按Trizol試劑(Invitrogen公司進口)說明提取組織總RNA,紫外分光光度計測定RNA含量。采用Fermentas反轉錄試劑盒按操作說明逆轉錄生成cDNA,產物進行PCR。AQP 4引物:上游序列5′-GGGTTGGACCAATCA TAGGCGCT-3′,下游序列5-GCAGGAAATCTGAGGCCAGTTCTAGG-3′,擴增片段長330 bp;GAPDH引物:上游序列5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′,下游序列5′-AGATCCACAACGGA TACA-3′,擴增片段長303 bp。退火溫度72℃,反應36個循環。PCR產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳結束后,將凝膠置于圖像系統處理分析,獲得目的基和GAPDH的吸光度值,以GAPDH的吸光度值作為內參照,計算出目的基因與GAPDH基因之間的比值,作為AQP4 mRNA表達的水平,引物合成為上海生工生物技術服務有限公司產品。

1.5 統計學處理 運用SPSS 12.0軟件進行處理,所有數據以均數±標準差(±s)表示,采用雙因素重復樣本的方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大體觀察 從打擊側冠狀切面可見:對照組大鼠在0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h等7個時間點腦組織表面光滑,溝回整齊、清晰、無充血、水腫及出血灶。TBI組腦損傷后0.5 h,皮質表面、蛛網膜下腔、挫裂傷灶周圍皮質及皮質下白質均有不同程度出血,略有腫脹。傷后2 h～6 h,蛛網膜下腔出血、皮質表面挫裂傷灶,周圍皮質及皮質下白質出血持續加重。12 h損傷最重,腫脹最明顯。72 h后,出血基本吸收,腫脹有所減輕,但水腫程度仍高于對照組。CGRP8-37組傷后0.5 h蛛網膜下腔、皮質和皮質下組織有少量出血,后逐漸加重,2 h出血最多,腫脹最明顯。6 h后出血開始吸收,水腫逐漸消退,72 h時溝回較整齊、基本無充血、水腫及出血灶。

2.2 免疫組化結果 TBI組大鼠傷后0.5 h腦組織CGRP陽性單位表達開始上調,2h、6h依次增高,12h達到高峰(P＜0.05),CGRP8-37組傷后0.5 h CGRP陽性單位表達也開始上調,隨著時間的延長表達持續升高,2h達高峰,然后持續回落,72 h恢復正常(P＜0.05)。CGRP8-37組在相應時間點CGRP陽性單位表達明顯低于TBI組,差異有統計學意義(P＜0.05)。對照組,TBI,CGRP8-37組創傷周邊區CGRP陽性單位表達不同,(F=59 124.926,P＜0.01)。對照組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之間CGRP陽性單位表達無統計學意義(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之間CGRP陽性單位總體有統計學意義(P＜0.01)。TBI組6 h和24 h、0.5 h和48 h CGRP陽性單位表達無統計學意義(P＞0.05)。時間和分組之間有交互效應(F=3 589.696,P＜0.01)。

2.3 腦組織CGRPmRNA的表達及其變化 TBI組大鼠傷后0.5 h腦組織CGRP mRNA表達開始上調,2 h、6 h依次增高,12 h達到高峰(P＜0.05),CGRP8-37組傷后CGRP0.5 hm RNA表達也開始上調,隨著時間的推移表達持續升高,2 h達高峰,然后持續回落,72 h恢復正常(P＜0.05)。CGRP8-37組在相應時間點AQP4mRNA表達明顯低于TBI組(P＜0.05)。對照,TBI,CGRP8-37組創傷周邊區CGRP mRNA表達不同(F=7198.397,P＜0.01)。對照組傷后0.5h、2h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h相互之間CGRP mRNA表達無統計學意義(P＞0.05)。TBI,CGRP8-37組傷后0.5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h之間CGRPmRNA總體有統計學意義(F=511.471,P＜0.01)。TBI組6 h和24 h、0.5h和48 h CGRPmRNA表達無統計學意義(P＞0.05)。時間和分組之間有交互效應(F=229.026,P＜0.01)。

3 討 論

CGRP是由Amana和Rosenfold等應用DNA基因重組和分子生物學技術于1982年首先發現的生物活性多肽,由37個氨基酸殘基組成,分子量是3 786.91。免疫組化顯示,CGRP樣免疫陽性神經細胞可見于中樞神經系統各部,特別是感覺神經元的胞體[2]。

降鈣素基因相關肽(Calcitoningene-related pep tide,CGRP)是辣椒素敏感感覺神經中主要的神經遞質,具有強大的血管舒張作用。CGRP具有拮抗內皮素(ET)-1的血管收縮效應。Nozaki等[3]的實驗證實其劑量依賴性,且作用強于SP、血管活性腸肽(V IP)等其他血管擴張介質[4]。

CGRP作為目前已知最強的內源性擴血管物質,其強大的擴血管作用能促進水腫的形成。具體機制是CGRP與受體結合后,激活鳥苷酸環化酶,促使細胞內環磷酸鳥苷水平升高,促進前列腺素釋放,進而血管通透性升高,血漿滲出,水腫形成。同時CGRP還能抑制P物質的降解,促使SP從感覺神經末梢釋放,有加強SP和其他炎性介質形成水腫的作用。CGRP不僅介導神經源性炎癥,還與一些炎性細胞、免疫細胞、炎癥介質和細胞因子有相互作用。CGRP能誘導人單核細胞合成IL-8等致炎因子,提高其m RNA表達水平[5]。Yamaguchi等[6]在做相似的研究中也發現CGRP能促使IL-1、IL-6和TNF-α顯著增加,并成時間劑量依賴性。

本實驗中,TBI組損傷區周邊CGRP陽性單位在損傷初期即急劇上升,隨著病情的進展,CGRP表達持續上升,12 h達高峰,這與損傷后痛覺神經末梢纖維致敏,釋放大量CGRP有關。隨后CGRP的表達回落,24 h,48 h,72 h持續下降,推測這是由于機體自身復雜機制的調節,如痛覺的逐漸適應和減輕,機體的免疫調節,以及機體內縮血管物質所致的拮抗作用。與TBI組相比,CGRP8-37組CGRP表達總體變化規律與前者一致,即都是先升高后降低,但后者峰值提前至2 h,且在相應時間點的表達都低于前者。CGRP8-37作為CGRP的受體拮抗劑,當其進入血腦屏障后,可與CGRP的受體競爭結合,從而使得CGRP表達量大大減少,同時又具有加快病理狀態的恢復作用,即具有減輕CGRP大量釋放所致的水腫和炎癥的作用。這與后續的動物觀察結果一致,TBI組大鼠在72 h后仍有一半不能正常進食和飲水,而給予CGRP8-37的大鼠在48 h后即有三分之二基本恢復正常,72 h時除個別外都能正常活動、進食和飲水。CGRP8-37作為CGRP的一種特異的受體拮抗劑,可以有效減輕CGRP引起的水腫和炎癥因子的釋放,加快病理狀態的恢復。這對于腦外傷所致的腦水腫甚至腦疝有很好的預防和治療作用。隨著對CGRP研究的不斷深入,將會有更多新的CGRP受體拮抗劑被研發出來,服務于臨床。

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