川芎嗪大鼠肝臟/腎臟缺血再灌注損傷中P-選擇素表達(dá)的影響

孫 磊,朱永康

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇南京,210009;2.江蘇省中醫(yī)院普外科,江蘇南京,210009)

臨床工作中肝臟、腎臟缺血再灌注損傷常見,是1個(gè)多因素的病理過(guò)程,目前尚無(wú)有效方法防治。其再灌注后引起活性氧的大量產(chǎn)生,巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的活化釋放大量炎癥介質(zhì),如 NF-κB、TNF-α、白介素-1(IL-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、P和L選擇素,繼而導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞死亡[1]。抗P-選擇素單克隆抗體可以減輕肝、腎缺血再灌注損傷程度。川芎嗪,是中國(guó)1種傳統(tǒng)的中草藥成份,常用于治療腦和心臟缺血再灌注損傷性疾病。在實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)它可以抑制中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā),減少自由基生成。本研究觀察川芎嗪對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷中P-選擇素表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 模型制備和分組

建立大鼠肝臟和腎臟缺血再灌注模型,參照Ohmori等[2]建立70%的大鼠肝臟和腎臟缺血再灌注模型,90只雄性W ister大鼠,體重(200±10)g,實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h,自由飲水,清潔手術(shù),直視下進(jìn)行,并控制室內(nèi)溫度18～25℃。

90只雄性W ister大鼠,隨機(jī)分為 2組。以2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。肝臟組:①假手術(shù)組5只:不阻斷肝動(dòng)脈、門靜脈左葉支;②缺血再灌注組20只:游離阻斷肝動(dòng)脈、門靜脈左葉支并以血管夾阻斷60min后松開再灌注,再灌注前5min經(jīng)靜脈給生理鹽水。按再灌注后 1、3、6、24 h取材分為4個(gè)亞組;③川芎嗪處理組:再灌注前5min經(jīng)靜脈給川芎嗪,余同缺血再灌注組。腎臟缺血再灌注組:①假手術(shù)組5只,不阻斷腎動(dòng)脈;②腎臟組:游離阻斷左腎動(dòng)脈60 min后松開再灌注同時(shí)切除右腎,再灌注前5 min經(jīng)靜脈給生理鹽水,按再灌注后 1、3、6、24 h取材分為4個(gè)亞組;③川芎嗪處理組:再灌注前5m in經(jīng)靜脈給川芎嗪,余同缺血再灌注組。迅速取出相同部位肝組織標(biāo)本,一部分置液氮中保存,送-70℃冰箱保存?zhèn)溆?另一部分組織置于10%中性福爾馬林溶液固定16～18 h后,石蠟包埋。

1.2 取材和檢測(cè)

各組再灌注末取血和肝或腎組織保存以備檢測(cè)。血清ALT、AST、BUN和CR值以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。肝或腎組織以10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋,切片做H-E染色行組織病理觀察,以免疫組織化學(xué)染色觀察肝、腎組織P-選擇素表達(dá)。M PO活性測(cè)定,采用Zingarelli等[7]的方法,以比活性(吸光度變化率/蛋白量)表示。NF-κB p65活性測(cè)定采用Western blot檢測(cè)NF-κB亞單位p65蛋白含量。

2 結(jié) 果

2.1 組織病理學(xué)變化

肝臟組:肝臟缺血再灌注損傷組再灌注1 h后,大體觀察可見肝左葉明顯腫脹,顏色暗黑。光鏡下間質(zhì)充血明顯并有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。而川芎嗪治療組中肝臟大體和光鏡下變化小,與正常肝組織相似(如圖1～3)。

圖1 正常肝臟組織 ×20

圖2 再灌注損傷組肝臟組織 ×20

圖3 川芎嗪治療組肝臟組織 ×20

腎臟組:腎臟缺血再灌注損傷組再灌注1 h后,大體觀察腎皮質(zhì)蒼白,腎髓質(zhì)淤血明顯。光鏡下可見大小不等范圍的腎小管上皮細(xì)胞變性壞死,間質(zhì)充血并有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而在川芎嗪治療組,缺血再灌注后腎臟大體和光鏡下變化小,與正常腎組織相似。

2.2 肝臟、腎臟功能檢測(cè)

肝臟組:再灌注2 h后,缺血再灌注組血清ALT值為(628±91)μ/L,AST值為(1 608±199)μ/L,與假手術(shù)組[ALT:(52±11)μ/L,AST:(80±17)μ/L]相比明顯升高(P<0.01);在川芎嗪治療組ALT值為(190±21)μ/L、AST值為(386±62)μ/L與缺血再灌注組相比明顯降低(P<0.01)。

腎臟組:再灌注24 h后,川芎嗪治療組組血清BUN值為(14.54±0.67)mmol/L,Cr值為(102.2±4.67)mmol/L與假手術(shù)組[(7.88±0.57)mmol/L,(39.00±4.47)mmol/L]相比明顯升高(P<0.01),而與缺血再灌注組[(11.21±0.56)mmol/L,(70.61±4.95)mmol/L]相比明顯降低(P<0.01)。

2.3 肝、腎組織中P-選擇素表達(dá)情況檢測(cè)

缺血再灌注組中,再灌注后1 h,肝臟和腎臟組織中有P-選擇素廣泛表達(dá)分布于肝左葉和左腎小血管內(nèi)皮細(xì)胞。在肝細(xì)胞膜,腎毛細(xì)血管絆以及間質(zhì)中也可發(fā)現(xiàn)有P-選擇素的表達(dá)。而在川芎嗪治療組中,肝、腎組織中P-選擇素表達(dá)不明顯。

2.4 肝血清酶學(xué)及缺血肝組織中MPO含量變化

肝臟組:再灌注24 h后,缺血再灌注組血清MPO水平為(7.09±0.67)U/g,與假手術(shù)組(2.95±0.3)U/g相比明顯升高(P<0.01);川芎嗪治療組MPO水平為(4.56±0.49)U/g與缺血再灌注組相比明顯降低(P<0.01)。

2.5 各組缺血肝組織中NF-κB P65蛋白表達(dá)比較

各組缺血肝組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)見圖4。肝組織內(nèi)NF-κB p65蛋白表達(dá)缺血再灌注組和川芎嗪治療組較假手術(shù)組均明顯升高(P<0.01);川芎嗪治療組NF-κB p65比缺血再灌注組明顯降低(P<0.01)。

圖4 肝組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)1:假手術(shù)組;2:缺血再灌注組;3:川芎嗪治療組

3 討 論

目前認(rèn)為缺血再灌注過(guò)程中粘附分子和白細(xì)胞發(fā)揮重要作用。缺血組織中大量白細(xì)胞,尤其中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)聚積與之關(guān)系密切。中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的滾動(dòng)主要有選擇素家族介導(dǎo),而它們之間的緊密粘附由免疫球蛋白家族如:ICAM-1、CD11/CD18等粘附分子介導(dǎo)。P-選擇素是選擇素家族中成員之一,正常情況下貯存于血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的Weibel-Palade小體和血小板的α顆粒中,在肝臟缺血再灌注過(guò)程中,當(dāng)細(xì)胞受刺激活化后P-選擇素迅速分泌到血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板表面,在再灌注早期對(duì)中性粒細(xì)胞的滾動(dòng)、粘附起重要作用。另一方面P-選擇素基因激活后,從轉(zhuǎn)錄水平使細(xì)胞表面表達(dá)P-選擇素,而此過(guò)程發(fā)生較晚。因此,P-選擇素在缺血再灌注過(guò)程中通過(guò)介導(dǎo)白細(xì)胞向組織內(nèi)的滾動(dòng)、粘附和浸潤(rùn)而發(fā)揮重要作用。運(yùn)用抗P-選擇素單克隆抗體可以減輕組織缺血再灌注損傷程度。川芎嗪是具有生物活性中草藥成份,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床工作中發(fā)現(xiàn)它對(duì)心臟、肺和腦等組織的缺血性疾病有治療作用。在對(duì)狗的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)川芎嗪能夠關(guān)閉鈣通道,減少血小板的聚集等生活效應(yīng),抑制自由基的釋放和動(dòng)脈中血栓的形成。然而,它對(duì)消化系統(tǒng)缺血性疾病的作用還未見有報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠肝臟、腎臟缺血再灌注損傷模型研究其對(duì)肝臟、腎臟缺血再灌注損傷的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,缺血再灌注組,血清中ALT 、AST 、BUN 和Cr值明顯升高,肝 、腎組織損傷明顯,而再灌注前5m in給予川芎嗪治療后,血清中ALT、AST、BUN和Cr值與I/R組相比明顯減低,病理學(xué)變化亦明顯減輕,表明川芎嗪能夠通過(guò)抑制白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用而減輕肝臟、腎臟缺血再灌注損傷程度。

缺血再灌注后肝、腎組織中P-選擇素表達(dá)明顯增強(qiáng),表明其與肝、腎缺血再灌注損傷密切相關(guān)。在缺血再灌注后的大鼠肝、腎組織中發(fā)現(xiàn),感染時(shí)白細(xì)胞的滾動(dòng)浸潤(rùn)延遲,表明P-選擇素在炎癥的早期過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,川芎嗪治療后,再灌注未肝、腎組織中 P-選擇素表達(dá)受到抑制。此結(jié)果也與抗P-選擇素單克隆抗體能夠下調(diào)sialyl Lew is X(白細(xì)胞表面P-選擇素的受體)的結(jié)果相一致[2]。這些表明P-選擇素在肝、腎缺血再灌注的早期階段發(fā)揮重要作用,降低P-選擇素的表達(dá)可以減輕肝、腎缺血再灌注損傷的程度。在對(duì)狗的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),川芎嗪能夠減少血小板表面a-顆粒的數(shù)量并能夠抑制血小板的活性和血栓的形成[3]。

肝臟再灌注后出現(xiàn)的另一個(gè)明顯的改變是Kupffer細(xì)胞的激活,Kupffer細(xì)胞激活后釋放多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子如 TNF-α、氧自由基、白介素-1和白介素-6等,其中最重要的是TNF-α。TNF-α能誘導(dǎo)和上調(diào)ICAM-1,由此促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于白細(xì)胞的黏附;促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血小板激活因子(PAF)等炎癥介質(zhì)激活白細(xì)胞,從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附,加重肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷并導(dǎo)致肝內(nèi)微循環(huán)紊亂,以上這些因素的共同作用加重肝臟缺血再灌注的損傷[1,3-5]。

NF-κB是一種普遍存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子,正常情況下,NF-κB與其抑制物 IκB結(jié)合,存在于靜止期細(xì)胞的胞漿中;當(dāng)誘導(dǎo)因子刺激后,IκB磷酸化降解,NF-κB激活進(jìn)入細(xì)胞核與基因啟動(dòng)子結(jié)合,誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄,其調(diào)控的靶基因有細(xì)胞因子(如 TNF-α)、黏附分子(如ICAM-1)等炎癥介質(zhì)[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn),在肝臟缺血再灌注損傷中,NF-κB被激活,從而上調(diào)TNF-α、ICAM-1等炎癥介質(zhì)的表達(dá)[8]。另有研究顯示,在心、肺、腦、腎、胃及小腸缺血再灌注損傷模型中,PPARγ激動(dòng)劑可通過(guò)抑制 NF-κB活性 下調(diào)TNF-α和 ICAM-1等炎癥介質(zhì)減輕再灌注損傷[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NF-κB再灌注后主要位于細(xì)胞核中,經(jīng)川芎嗪處理后細(xì)胞核中的NF-κB的數(shù)量明顯減少,同時(shí)受其調(diào)控的TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)量亦相應(yīng)降低。由此推測(cè),川芎嗪是通過(guò)抑制NF-κB活性,減少TNF-α、ICAM-1等炎癥介質(zhì)的釋放,從而減輕了再灌注引起的炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)顯示,川芎嗪治療組血清ALT、AST水平較缺血再灌注組明顯降低,這說(shuō)明經(jīng)過(guò)川芎嗪處理后,肝細(xì)胞損傷減輕,肝臟功能得到了有效改善。由于組織中中性粒細(xì)胞數(shù)目與組織中MPO的含量成正比,本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了肝臟組織MPO的含量代表肝臟組織中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。本實(shí)驗(yàn)表明,在缺血再灌注組中MPO的含量最高,而應(yīng)用川芎嗪后組織中MPO的含量明顯減少,說(shuō)明川芎嗪有效的保護(hù)了肝竇內(nèi)皮細(xì)胞,抑制了Kupffer的激活,使白細(xì)胞浸潤(rùn)減少,從而減輕了白細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。上述結(jié)果說(shuō)明川芎嗪可減輕再灌注后肝細(xì)胞損傷。

[1] Len tsch A B,Kato A,Yoshidome H,et al.Inflammatory mechanisms and therapeutic strategies for warm hepatic ischem ia/reperfusion inju ry[J].Hepatology,2000,32:169.

[2] Ohmori M,M iyashita F,Uchida H,et al.Effect of erythromycin on ischem ia-reperfusion inju ry of liver in rats[J].T ransplant Proc,2000,32(4):811.

[3] Banga N R,Homer-Vanniasinkam S,Graham A,et al.Ischaem ic p recondi-tioning in transplantation and major resection of the liver[J].Br JSurg,2005May,92(5):528.

[4] Jaeschke H.Mechanism sof Liver Injury.II.M echanismsof neutrophil-induced liver cell injury during hepatic ischem iareperfusion and other acute inflammatory conditions[J].Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol,2006 Jun,290(6):G1083.

[5] Perkins N D.Integrating cell-signalling pathw ays with NF-kappaB and IKK function[J].Nat Rev M olCell Biol,2007,8(1):49.

[6] Grivennikov S I,Kuprash D V,Liu ZG,et al.Intracellular signals and eventsactivated by cytokinesof the tumor necrosis factor superfam ily:From sim ple paradigms to complex mechanisms[J].In t Rev Cytol,2006,252:129.

[7] MatsuiN,Kasajima K,HadaM,etal.Inhibiton of NF-kappaB activationduring ischem ia reduceshepatic ischem ia/reperfusion injury in rats[J].JToxicolSci,2005,30(2):103.

[8] Sato N,Kozar R A,Zou L,et al.Peroxisome proliferatoractivated receptorgamma mediates protection against cyclooxygenase-2-induced gut dysfunction in a rodent model of mesenteric ischemia reperfusion[J].Shock,2005 Nov,24(5):462.

[9] Kersten S,Desvergne B,Wah liW.Rolesof PPARs in health and disease[J].Nature,2000,405:421.

[10] Abdelrahman M,Sivarajah A,Thiemermann C.Beneficial effectsof PPAR-gamma ligands in ischemia-reperfusion injury,inflammation and shock[J].Cardiovasc Res,2005,65(4):772.

[11] Luedde T,Trautwein C.Intracellular survival pathways in the liver[J].Liver Int,2006,26(10):1163.