苜蓿提取物抗炎鎮痛作用的實驗研究

李蘭芳 李存滿 張勤增 郝娜 解麗君 李國風

紫苜蓿為多年生草本豆科苜蓿屬植物,是我國種植面積最廣,營養價值最全面的牧草。民間用全草治療痢疾、黃疸、尿酸性膀胱結石、尿路結石和浮腫等[1]。苜蓿多糖具有增強免疫和抗腫瘤作用[2]。近年國內、外學者研究了苜蓿皂苷降低實驗性高膽固醇血癥,并在幾種動物得到證實[3,4]。本文研究紫苜蓿提取物對實驗動物抗炎、鎮痛方面的藥理作用,為紫苜蓿的進一步深開發提供了一定的實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SD大鼠和昆明種小鼠.購于河北省實驗動物中心,動物許可證號：SCXK(冀)2003-1-003合格證編號分別為：DK0412-0078,604076,DK0502-0067,604107,604075。

1.2 實驗藥品與儀器 紫苜蓿,采自河北滄州黃驊苜蓿基地,經河北省藥檢所鑒定為紫苜蓿全草,紫苜蓿干品,加 10倍量水,浸泡 2h,煎煮 2次,45 min/次,合并兩次煎煮液并濃縮至適量,加乙醇至含醇量達 70%,4℃冷藏過夜,過濾,濾液回收乙醇,并濃縮至 1 g生藥/m l的濃度,作為實驗用樣品溶液;角叉菜膠(Carrageean),Sigma公司生產;阿司匹林片,25mg/片,石家莊神威藥業股份有限公司生產(批號：20020710)醋酸潑尼松,山東新華制藥廠(批號：2000902)DT2000電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠;JA 2003電子分析天平,上海精密科學儀器有限公司;TDL-5-A型離心機,上海安亭科學儀器廠。

2 方法與結果

2.1 對二甲苯引起的小鼠耳腫脹的影響[5]健康昆明科小鼠50只,體重(20±2)g,隨機分為 5組,即模型組、陽性藥組(醋酸潑尼松,12mg/kg)、紫苜蓿提取物 3個劑量組(40.0、20.0、10.0 g生藥/kg),每組 10只,5組均灌胃給藥,連續 3 d,給藥體積為 20m l/kg。末次給藥后30min,將二甲苯滴于小鼠右耳,15min處死動物,用 6mm打孔器沿左、右耳廓相同部位打孔,兩側耳片分別稱重,以兩耳片重量差值作為腫脹程度指標,求出抑制率,比較各組差異。見表 1。紫苜蓿提取物 40.0、20.0、10 g生藥/kg連續給藥 3 d,對二甲苯引起的小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用(P＜0.05或 ＜0.01)。高、中劑量組對小鼠耳腫脹的抑制率同醋酸潑尼松相當。

表 1 紫苜蓿提取物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 n=10

2.2 對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響[5]取健康SD大鼠50只,雄性,隨機分為 5組,即空白對照組(0.9%氯化鈉溶液)、陽性藥組(阿司匹林 24mg/kg)、苜蓿提取物 3個劑量組(30.0、15.0、7.5 g生藥/kg)。 5組均灌胃給藥 5 d,于最后 1 d給藥后 1 h,于大鼠右后足趾皮下注入 1%角叉菜膠 0.1m l/只,致炎后 1、2、4、6h分別測定足趾厚度,計算腫脹率,分別比較各時間點給藥組與模型組之間的差異。結果見表 2。苜蓿提取物高、中、低劑量組從致炎后第 4小時開始有明顯的抑制作用,持續到 6 h時抑制作用更為明顯,與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05或 ＜0.01),抑制作用強度同阿司匹林組相當。

表2 紫苜蓿提取物對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響n=10,±s

表2 紫苜蓿提取物對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響n=10,±s

注：與模型組比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

組別 劑量(g生藥 /kg)致炎后不同時間腫脹率(%)1h 2 h 4 h 6 h模型組 - 38±9 61±21 71±25 68±24高劑量組 30.0 36±10 46±12 43±20＊ 36±17#中劑量組 15.0 44±10 48±10 49±15＊ 43±13#低劑量組 7.5 41±13 48±16 50±13＊ 45±17＊阿司匹林組 24mg/kg 42±8 50±11 52±9＊ 42±10#

2.3 對大鼠棉球肉芽腫增生模型的影響 選用 SD大鼠 50只,雌雄各半,體重(150±20)g乙醚麻醉,背位固定,下腹部去毛,常規皮膚消毒。下腹部切口,以血管鉗向左右兩側蹊部擴充皮下組織,將已稱重并滅菌干燥的 30mg棉球植入皮下,縫合傷口。于術后當天,將動物隨機分為 5組,每組 10只,分別為紫苜蓿提取物 3個劑量組(30.0、15.0、7.5 g生藥/kg),陽性對照藥給予醋酸潑尼松(8mg/kg)和模型組。5組均灌胃給藥,灌胃容積均為 2.0ml/100g,模型組給予蒸餾水,1次/d,連續 7 d。于第 8天脫臼處死動物,取出棉球,精稱濕重,于 60℃烤箱干燥12 h,精稱干重,減去原棉球重量即為肉芽腫凈重(mg)。與模型組比較,醋酸潑尼松(25mg/kg)效果顯著(P＜0.01);紫苜蓿提取物高、中劑量組(30.0、15.0 g生藥/kg),對大鼠棉球肉芽腫增生均有明顯抑制作用(P＜0.01)。見表 3。

2.4 對醋酸所致小鼠疼痛反應的影響 選用健康昆明種小鼠50只,雌雄各半體重(18±2)g,隨機分為 5組,模型組、陽性藥組(阿司匹林片,30mg/kg),紫苜蓿提取物 3個劑量組(40、20、10 g生藥/kg。各組均灌胃給藥,連續 5 d,給藥體積為20ml/kg。末次給藥后 1 h,腹腔注射 0.6%醋酸溶液,0.2m l/只。觀察記錄各組小鼠 30m in內扭體次數,比較各組動物扭體次數差異。見表 4。與模型組比較,紫苜蓿提取物 40、20、10 g生藥/kg連續給藥 5 d,可明顯減少醋酸引起的小鼠疼痛模型的扭體次數(P＜0.01)。作用強度與陽性藥阿司匹林相當。

表3 苜蓿提取物對大鼠棉球肉芽腫增生的影響n=10,±s

表3 苜蓿提取物對大鼠棉球肉芽腫增生的影響n=10,±s

注：與模型組比較,＊P＜0.01

組別 劑量(g生藥/kg)肉芽腫濕重(mg, ±s)肉芽腫干重(mg,±s)抑制率(%)模型組 - 420±43 57±10 -醋酸潑尼松組 10mg/kg 340±38＊ 30±7＊ 47.52高劑量組 30.0 368±39＊ 39±10＊ 32.26中劑量組 15.0 366±40＊ 45±10＊ 20.80低劑量組 7.5 394±51 49±16 14.04

2.5 對熱水縮尾法疼痛模型的影響[5]取健康昆明種小鼠,雌雄兼用,體重(18±2)g,將小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃恒溫水浴鍋中,記錄其縮尾的潛伏期為痛閾指標,測兩次(間隔10min),求其平均值,取潛伏期是 5～30 s的為合格鼠,剔除過敏(＜5 s)或反應遲鈍(＞30 s)的個體。24h后進行實驗,取合格小鼠 50只,隨機分為 5組,即苜蓿提取物 3個劑量組(40、20、10 g生藥/kg),陽性藥組(阿司匹林 30mg/kg)和空白對照組,每組 10只。5組動物均灌胃給藥 3 d,空白對照組給予蒸餾水。末次給藥后 30min,將小鼠尾尖端 3 cm浸入 50℃的恒溫水浴鍋中,測定各組小鼠的縮尾潛伏期,以小鼠尾回縮出水面的潛伏期作為測痛指標。苜蓿提取物高、中劑量組能提高熱水縮尾實驗中小鼠縮尾的痛閾,使縮尾潛伏期延長,與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05或 ＜0.01)。見表5。

表4 苜蓿提取物對醋酸所致小鼠疼痛模型的影響 n=10

表 5 苜蓿提取物對熱水所致的小鼠縮尾潛伏期的影響 n=10

3 討論

炎癥的臨床特征為紅、腫、熱、痛,是致炎因子刺激具有血管系統的活體組織對局部損傷的反應。在炎癥早期,血管受到刺激,血管內皮間隙擴大,血管壁通透性增強,白細胞和蛋白質等滲出到組織間隙,造成組織腫脹。因此,腫脹是炎癥早期的重要指標。在炎癥晚期和慢性炎癥期,由于內皮細胞、纖維母細胞和實質細胞等增生,形成肉芽組織增生。

本文采用炎癥腫脹模型觀察了苜蓿水煎液用 70%乙醇沉淀后的提取物對二甲苯引起小鼠耳腫脹和角叉菜膠對大鼠足趾腫脹的影響,在本實驗劑量下,苜蓿提取物能對炎癥早期的組織腫脹有顯著的抑制作用。采用在大鼠皮下埋植棉球的方法,觀察到苜蓿提取物對炎癥的增殖期肉芽腫形成有顯著的抑制作用。提示苜蓿提取物既能抑制炎癥早期的水腫和滲出,又可抑制炎癥晚期的組織增生和肉芽組織的形成,顯示了很好的抗炎作用。

疼痛是由于痛覺感受器受到刺激而產生興奮,沖動經傳入神經纖維到達大腦某些神經細胞,或中樞通路的某一水平受損時所產生的一種不舒適的感覺。引起疼痛的原因眾多,本文采用化學刺激致痛法觀察到,苜蓿提取物對醋酸引起的疼痛有顯著的抑制作用。對熱刺激引起的疼痛也有較明顯的延長反應潛伏期的作用。

前期研究有關于苜蓿可以協同 PrCl3鎮痛作用的報道[6],有關苜蓿單獨使用在抗炎、鎮痛方面尚未見相關報道。苜蓿化學成分復雜,現已確定皂苷類、黃酮類、蛋白、多糖等,活性研究集中在營養、調節血脂等。但在本研究采用抗炎和鎮痛模型證實了苜蓿提取物有很好的抗炎痛作用。并且發揮藥效時間短,作用持續時間長,存在一定的劑量效應。

但本實驗對苜蓿提取物的抗炎、鎮痛作用只是進行了初步的研究。提取方法采用水煎醇沉的傳統方法,其中的成分比較復雜,動物的服用劑量較高,在以后的工作中擬對苜蓿提取物有效部位和化學成分進行進一步分離和純化和鑒定,確定苜蓿抗炎、鎮痛的有效成分,進一步探討其抗炎、鎮痛機制及其在體內的代謝規律,為苜蓿的進一步開發和臨床應用提供更多的實驗依據。

1 宋立人,洪恂,丁旭亮,等主編.現代中藥學大辭典(上冊).第 1版.北京：人民衛生出版社,2001.1237.

2 趙武迷,張玉琴,任麗娟,等,苜蓿多糖的免疫增強效應.中國藥理學報,1993,14：273-276.

3 Malinow MR,Mc laughlin P,Stafford C,etal.Alfalfasaponinsand alfalfasccds dietary effects in cholesterol-fed rabbits.Atherosclerosis,1978,30：27.

4 叢學滋,秦孟根,李子行,等.苜蓿皂甙的降血膽固醇及減輕實驗性動脈粥樣硬化形成的作用.中國藥理學通報,1988,4：293-296.

5 徐叔云主編.藥理實驗方法學.第 3版.北京：人民衛生出版社,2002.882-888,911.

6 楊蔚,王紹.PrCl3與苜蓿皂甙的協同鎮痛作用.白求恩醫科大學學報,1995,21：571-573.