副溶血弧菌的快速鑒定檢測方法研究進展

楊芳 李秀娟 徐保紅

副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus,VP)是一種革蘭陰性嗜鹽桿菌,是引起食源性疾病的重要病原之一。該菌主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產品中,是沿海地區引起食物中毒的重要病原菌。它在海產品上的帶菌率高達45.7%[1],其生長速度是一般細菌(如大腸桿菌、沙門氏菌等)的 2倍,因而更易于引起食物中毒。常規的 VP的檢測方法包括增菌培養、選擇性培養、生化試驗和血清學反應等過程,耗時長、操作繁瑣、檢出率低,不適應實際檢驗工作的需要。隨著科學技術的發展,一些快速檢測方法以其特異性強、敏感性高、分辨率高、操作簡單、穩定性好、耗時短的優點逐漸取代常規的檢測方法,在病原菌檢測方面有著廣泛的應用前景。本文就VP的快速檢測方法綜述如下。

1 聚合酶鏈式反應(PCR)技術

由于 PCR技術具有敏感、快速、特異性強、操作簡單等特點,在微生物的鑒定檢測方面展現了巨大的潛力。以常規的分離培養方法檢測 VP耗時長,需要 4～5 d,而采用 PCR法進行檢測,只需要 10 h,不僅節省了時間,且可提高檢測通量,一次可檢測多達 96份樣品。Kim等[2]建立了以 toxR基因為靶基因采用 PCR方法檢測了 373株 VP和 290株其他菌株,結果表明373株VP都攜帶toxR基因而非 VP菌株結果均為陰性。Venkateswaran等[3]針對 VP的 gyrB基因進行 PCR引物設計,擴增片段大小為 285 bp,運用該 PCR方法檢測來自環境、食品和臨床樣品中的 VP,共 117菌株,結果表明所有的菌株都能擴增出258bp的基因片段。除了 toxR、gyrB基因外,也可采用 tl、tdh、tlh、trh、Fla基因和 pR72H片段等[4-8]來檢測 VP。

1.1 多重 PCR技術 Bej等[9]針對 VP的 tlh基因、tdh基因、trh基因用多重 PCR方法檢測貝類中的 VP。檢測結果表明：從臨床、海產品、環境和牡蠣中分離得到的 111份 VP菌株,用該方法對所有的 VP菌株全部擴增出tlh基因,60份 VP菌株擴增出 tdh基因,43份VP菌株擴增出trh基因。該方法的靈敏度較高,10 g牡蠣組織增菌肉湯的最低檢測量為 10～100 cfu[10]。吳彩云等[11]通過對反應體系中各組分含量的優化及循環參數的摸索,確立了同時檢測 t1和tdh基因的多重 PCR技術,結果與常規 PCR的一致。該法不僅具有常規 PCR的優點,而且還能節省時間及 Taq酶、dNTP等材料,還可盡量減少或避免因操作步驟過多因污染所帶來的假陽性等問題[12]。

1.2 實時 PCR方法 實時 PCR由于擴增與檢測在封閉單管內進行,因此能夠避免常規PCR方法易污染的缺點,并且實現了 PCR從定性到定量的飛躍,具有很好的應用前景。Kaufman等[13]針對tlh基因建立了檢測VP的實時熒光定量 PCR方法,結果表明該方法可在 1 h之內定量檢測出牡蠣中的VP。Takahashi等[14]針對 VP的 toxR基因也建立了實時熒光定量 PCR方法檢測海水、貝類中的 VP,最低檢出限為 36 cells/m l。Blackstone等[15]建立的一種基于熒光探針的檢測 VP的(針對其 tdh基因)實時 PCR方法。結果表明,只有攜帶 tdh基因的 VP能產生熒光信號,并且與攜帶tdh基因的陰性弧菌或者其他細菌無交叉反應。該方法檢測 VP的tdh基因特異性強(僅檢測攜帶tdh基因的陽性 VP),靈敏度高(1 cfu/PCR反應體系),快速(整個實驗 24h內就可以完成,檢測不到 1h就可完成)。Ward等[16]建立了基于TaqMan熒光探針的多重實時 PCR方法檢測貝類中 VP的 tlh、tdh、trh和 ORF8基因,結果表明該方法可用于檢測基因組 DNA和菌純培養物,其靈敏度分別為 200 pg和1×104cfu/m。

1.3 MPN-PCR方法 MPN法(most probable number,最可能數法)采用多管發酵法,通過幾率計算,測定樣品中細菌的最可能數,達到定量的目的。MPN法與 PCR法的結合可達到定量和提高檢出限的目的。欒曉燕等[17]根據 VP的 tdh、trh、tlh基因序列設計了 3對特異性引物,通過增菌培養、樣品處理、PCR擴增,并且結合了MPN法,實現了對水產品中的 VP快速定量檢測。該方法的最低檢出限為12 cfu/ml比直接進行PCR擴增的最低檢出限(1.22×103cfu/m l)提高了 100倍,對 tlh、tdh、trh基因的特異性強,整個檢測過程不超過 16 h。Blanco-Abad等[18]分別用 A/P(Absence-Presence)-PCR和 MPN-PCR法進行鑒定 VP,比較了這兩種方法的高效性和靈敏性,結果證明MPN-PCR法優于 A/P-PCR法,可實現快速、準確檢測 VP。

2 UPPCR-SSCP

通用引物 PCR(UPPCR)和單鏈構型多態性(SSCP)相結合進行檢測具有很高的靈敏度和特異性,可以將病原菌分辨到種。16s RNA基因因保守性高,又有一定的隨科、屬、種不同而有不同程度差異的變異區,被認為是分類及臨床檢測鑒定的最有用的靶基因。以細菌 16s-RNA基因保守區設計引物,對其可變區進行 PCR擴增后,結合特異性探針雜交、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)或直接測序等手段就可以把病原菌定位至種。彭宣憲等[19]以 16s RNA基因為目的片段,采用通用引物 PCR配合 SSCP分析(UPPCR-SSCP技術),對弧菌科弧菌屬中的 VP、溶藻酸弧菌等進行了檢測。結果發現 SSCP技術能較好地鑒別細菌的不同種,但對同種不同株細菌的區分較困難。結合對不同科屬種細菌的 UPPCR的結果,可以認為種間差異的 SSCP圖譜與親緣關系似乎有一定聯系,即親緣關系越近則差異越小;反之,則差異越大?？傊?若建立有關病原菌的 SSCP電泳圖譜,可用于病菌的快速檢測。

3 DNA雜交

Mccarthy等[20]建立了兩個無輻射探針堿性磷酸酶(AP)標記的探針和地高辛(DIG)標記的探針檢測 VP的 tlh基因。對26株 VP、88株其他弧菌和 10株非弧菌物種用 AP標記探針進行特異性實驗,結果表明只有 26株 VP弧菌與 AP探針雜交,種屬特異性強。對從牡蠣中分離的 206株疑似VP的檢測結果顯示 AP標記探針和API-20E鑒定的結果一致性為 97%。對 584株疑似 VP的檢測結果顯示AP標記探針和DIG標記探針檢測結果一致性達 98%?；?AP和 DIG標記探針的方法,Gooch等[21]通過AP探針(Direct-VPAP)和 DIG探針(Direct-VPDig)以及 MPN-VPAP3種方法對不同季節和儲存條件下的牡蠣中VP進行定量檢測,結果經回歸分析顯示 MPN-VPAP方法檢測VP與 Direct-VPAP、Direct-VPDig方法檢測 VP的效果是一致的,但靈敏度不同。對 0.1 g的樣品進行檢測結果表明 MPNPCR法的靈敏度為 3MPN/g,而其他兩種方法的靈敏度為10 cfu/g,因此MPN-PCR法在 VP低濃度時表現出高靈敏性。而在 VP含量較高時利用 Direct-VPAP、Direct-VPDig方法進行檢測,則更快速、經濟和省力。Banerjee等[22]建立了一種 DNA探針快速檢測 VP的方法。在hydrophobic grid membrane filters(HGMF)方法中,將固定在 HGMF上 VP-DNA模板與 DIG標記的 tdh基因探針進行雜交后檢測VP。盡管經過富集培養后可以在 1 d之內檢測出VP,但是由于該方法引入了 DNA分離、DIG標記探針的合成、VP引物的設計和克隆雜交,使其操作步驟復雜化。

4 LAMP檢測方法

LAMP(核酸擴增-環介導等溫擴增技術)是一種新穎的檢測VP的方法。LAMP技術依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區域的 4條特異性引物和一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶在恒溫條件下對核酸進行擴增,具有高特異性、快速簡便、高效性等特點。徐芊等[23]針對VP的tlh基因設計四條特異性引物進行 LAMP擴增,并對擴增反應進行優化,反應時間為 1 h,反應溫度為 60℃。結果表明 LAMP檢測 VP特異性強、檢測靈敏度高、操作簡便、檢測成本低,有望發展成為快速檢測VP的有效手段。

5 Transcrip tion-reverse transcrip tion concerted(TRC)方法

TRC是用于檢測mRNA的一種新研制的方法,它是將目標RNA序列反轉錄成 cDNA,經過dsDNA轉錄成 RNA后插入活性熒光 DNA探針(INAF DNA探針),通過實時熒光檢測器在一恒定的溫度下定量檢測 TRC反應中的熒光強度,然后根據反應時間和熒光強度比率作圖。在 tdh-TRC與trh-TRC方法中反應 30m in后,樣品的熒光強度比率≥1.2認為是陽性,＜1.2的為陰性。Masuda等[24]新建立了快速、靈敏的 TRC方法定量檢測 VP中 tdh和trh基因的 mRNA轉錄。針對提取來自 24株VP,31株其他弧菌屬,8株非弧菌屬的 RNA檢測結果表明：用TRC方法分別檢測tdh和 trh的 mRNA的結果與用 DNA克隆技術檢測結果一致,靈敏度為 100 cfu。但 tdh-TRC只檢測 tdh mRNA;菌株攜帶任何 tdh的不同基因(tdh1-tdh5)都呈現陽性的結果而攜帶 trh基因(trh1或 trh2)都呈陰性。同理,trh-TRC方法只對攜帶trh基因的VP表現出陽性結果。因此,TRC方法檢測 VP的致病基因具有簡單、特異、快速的特點,同時 TRC原理也可用于檢測其他致病菌。

6 免疫學方法

6.1 間接免疫熒光抗體方法 樊景鳳等[25]建立了 VP的間接免疫熒光抗體檢測方法,該方法將細菌固定于載玻片上,滴加免疫血清,37℃孵育 30 m in;用 PBST(含 0.5%Tween-20的0.01mol/L,pH=7.4的 PBS)洗滌 3次,滴加 FITC標記的羊抗兔 LgG,37℃孵育 30m in;用 PBST洗滌 3次,干燥后滴加 PBS緩沖的甘油(PBS∶甘油 =1∶9)1滴,加蓋玻片,在其上加 1滴無自發熒光的香柏油,用落射熒光顯微鏡進行觀察。交叉反應和阻斷試驗證明該方法的特異性較高,并且該方法具有快速、簡單的優點適用于現場的應用推廣。

6.2 間接酶聯免疫吸附法 竇勇等[26]建立了用于 VP的間接酶聯免疫吸附法。該方法標準化后進行測定,交叉實驗與阻斷實驗表明其具有較高的特異性,并且檢測時間短,準確度高,可快速檢測 VP。王軍等[27]用 0.5×10-3(V/V)甲醛、30℃作用8 h滅活病原菌制成菌苗。用該菌苗免疫新西蘭兔獲得特異性抗血清,以辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG為標記第二抗體,對 VP進行間接 ELISA快速檢測,其最低檢測極限為 5×104cfu/cm3?，F場檢測即將大黃魚肝臟粗研磨后加入 5倍體積的無菌 0.9%氯化鈉溶液繼續研磨,取上清液檢測;水樣直接檢測。結果表明間接 ELISA檢測法可用于 VP的快速檢測。

6.3 斑點 ELISA法 斑點 ELISA法是一種樣品處理上的創新方法,針對 VP產生 TDH和 TRH的特點,將菌株培養液的上清點樣于硝基纖維膜上,干燥后以 BSA封閉,再在點樣處加TDH和 TRH抗體,過夜后與第二抗體反應,最后加底物產生顏色反應指示結果。很顯然這種方法更適合處理大量樣本。臧紅梅等[28]用斑點ELISA技術檢測VP,通過交叉實驗與阻斷實驗表明該方法的特異性好,重復性好,批內和批間結果相同,無差異。通過免疫血清敏感性試驗結果得知,當 VP菌量低于104cfu/ml時,不易檢出。斑點ELISA法雖然特異性強,但靈敏度不高,還有待進一步提高其靈敏度。提高靈敏度的方法有：AB(avidin biotin system)-ELISA法;PCR-ELISA法;斑點免疫酶結合試驗(DIA)等。

7 熒光分析法

VP具有代謝阿拉伯糖的能力,在阿拉伯糖-葡萄糖醛酸鹽培養基(AG)培養基上經過選擇性增菌后的VP具有較高胰蛋白酶樣活性,而其他菌株的胰蛋白酶活性則可忽略,并且VP胰蛋白酶活性不受其他菌株濃度的影響,僅與增菌前VP的濃度有關。高旗利等[29]用此方法檢測水產品中是否污染有 VP。結果表明該方法靈敏度為20個/g,只需 8h就可完成水產品中VP的初篩檢驗。操作簡便、靈敏度較高,適于快速檢測需要。

8 傳感器技術

8.1 電化學技術 抗原-抗體結合前后可導致多種信號的改變,如：重量、光學、熱學、電化學等,電化學免疫傳感器可通過感應抗原-抗體結合前后的電化學變化來實現對病原微生物的定性和定量檢測。Zhao等[30]將HPR標記VP抗體摻于瓊脂糖和納米金中并修飾于絲網印刷電極的表面,制備一次性電化學免疫傳感器來快速檢測VP。然后采用循環伏安法表征免疫電極和檢測酶促反應,根據免疫復合物屏蔽 HRP活性中心引起還原電流的變化來定量檢測VP。在優化的實驗條件下,免疫電極的線性檢測范圍為 105～106cfu/m l,檢出限為 7.4×104cfu/ml(S/N=3)。該免疫電極具有較好的特異性、重現性(RSD＜6%)、穩定性(1周后電流響應為初始值的 91%)和準確性(與 ELISA符合率為 97.5%),可用于 VP的快速篩選。

8.2 電子鼻技術 微生物在生長代謝過程中可產生特有的揮發性代謝產物,具有微生物種的特異性,而電子鼻技術是檢測揮發性成分的人工嗅覺裝置,針對微生物的揮發性代謝產物實現對微生物的檢測。胡惠平等[31]利用電子鼻技術對從從南美白對蝦中分離的一株VP進行檢測。實驗采用具有 18個金屬氧化物傳感器的 Fox 4000電子鼻對 VP經純培養后產生的揮發性代謝產物進行檢測,同時用空白 3.5%氯化鈉TSB培養液作為對照。將電子鼻獲得的樣品數據用主成分分析(PCA)、判別因子分析(DFA)、單類成分判別分析(SMICA)等多元統計方法進行分析。結果顯示,VP經純培養后產生了明顯不同于空白培養液氣味的揮發性代謝產物?？梢?電子鼻可應用于純培養微生物的檢測,實現對VP無損、快速檢測。

9 VP快速測試片

許如蘇等[32]以法國進口弧菌顯色培養基為主要原料,運用微生物測試片專有技術,制成一次性 VP快速檢測片。并對其檢測性能進行測試研究。結果表明該測試片對純菌的檢測靈敏度達到 8 cfu/m l,與霍亂弧菌、溶藻弧菌等 17種非目的菌無交叉反應;重復性試驗結果相對偏差低 8%;24h可完成檢驗工作。應用該測試片檢測人工染菌樣品和自然樣品,檢測結果與GB或SN標準方法一致。因此,VP快速測試片具有敏感度高、特異性強、重復性好、操作簡便等優點,可用于食品和水產品中 VP的快速初篩。

10 基因芯片(Gene Chip)

近年來基因芯片技術在微生物檢測領域的發展將會充分發揮準確及高通量并行檢測的優越性。以基因微陣列為基礎的芯片,可大大提高工作效率,減少人為誤差,實現微生物的自動化檢驗。李君文等[33]利用 16SrRNA基因作為檢測的靶基因,在其恒定區設計 PCR引物,在可變區設計檢測探針：用1對PCR引物就可以將所有細菌的相應基因片段全部擴增出來(擴增時 1條PCR引物采用熒光標記),再用每種細菌的特異性探針陣列與標記的靶片段進行雜交反應,雜交后用專用設備讀取分析熒光信號,可以定性和半定量地檢出致病菌。用這種芯片可以特異地檢出水中 VP、軍團桿菌、李斯特菌等。結果表明基因芯片技術檢測水中常見致病菌可以實現高通量、并行檢測,一次實驗即可得出全部結果;特異性強、敏感性高、操作簡便、快速(檢測時間約 4h)。

以上總結了 VP各種快速檢測方法,但綜合來看,每種方法都有其優缺點,在定性和精確定量方面難以兼顧。微生物鑒定實驗需要積累和吸取實驗經驗,技術含量高,但是隨著分子生物學的飛速發展,新的技術、儀器設備不斷出現,如基因芯片技術;檢測技術也不斷完善,特別是各種分子技術的融合與創新,如 PCR、DNA雜交、ELISA三大現代分子生物學技術的聯用,為VP的快速檢測提供了強大的工具,必將會實現VP快速、準確、靈敏、特異、大規模的檢測。

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