HIV/AIDS實驗室檢測進展

魏明 田臨紅 程義新

HIV/AIDS實驗室檢測進展

魏明 田臨紅 程義新

獲得性免疫缺乏綜合征;臨床實驗室技術;進展

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome)簡稱艾滋病(AIDS),是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H IV)感染所引起的一種嚴重的傳染性疾病。實驗室檢測一直是診斷 HIV/AIDS的主要依據。自1985年第一代 HIV抗體問世以來,HIV病原學檢測方法有了長足的進步。各種檢測 HIV的新技術層出不窮,實驗室檢測方法也在不斷提高和更新。本文就近年來 HIV/AIDS實驗室檢測的研究進展綜述如下。

1 HIV的結構特點

H IV呈球形或卵形,直徑 90～130nm,包膜由病毒特有的蛋白質附著于一薄層類脂質構成。其核心含有兩條相同拷貝的 RNA鏈,其外周是由多種蛋白質形成的核膜。HIV同其他逆轉錄病毒一樣,基因組中存在三個大的開放讀框,其順序是gagpolenv.Gag基因編碼 55 kD的前體蛋白,在病毒成熟過程中,被 pol基因編碼的蛋白酶加工,分別產生核心蛋白 P17,核殼蛋白 P24和核酸結合蛋白 P15。P24是核殼組成蛋白,構成病毒的核衣殼,它的結構比較穩定,是 HIV-1型的特異性蛋白。在 H IV-2與 P24對應的是主要核心抗原 P32,為 HIV-2型病毒感染的特異標志。Env編碼包膜蛋白,由外膜糖蛋白 gp120和跨膜糖蛋白 gp41組成 (在 HIV-2型病毒中與之相當的是gp110/130和 gp36)[1]。CD4是 HIV最重要的靶細胞,在 CD4淋巴細胞內反轉錄酶將 RNA逆轉錄成前病毒DNA,接著整合到宿主細胞基因組 DNA中,而后和細胞一起復制。

2 HIV抗體檢測

迄今為止,血清學實驗依然是 HIV實驗室診斷的主要依據[2]。血清學實驗即H IV抗體檢測,是 HIV感染診斷的常規方法,分為初篩實驗和確認實驗兩個步驟。

2.1 初篩實驗 包括酶聯免疫吸附實驗(ELISA)、快速檢測(RT)實驗、尿液 HIV抗體檢測等。常用的初篩實驗是酶聯免疫吸附實驗(ELISA),ELISA試劑在經過了第 1代、第 2代、第3代后,已經發展到第 4代檢測試劑[3]。1985年,美國 FDA批準使用第 1代ELISA檢測試劑,第1代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應板,以檢測血清中的抗體。由于包被的抗原不很純,假陽性率較高,結果不令人滿意。1990年,第 2代試劑應運而生,第 2代試劑使用了基因工程的重組或人工合成多肽 HIV抗原包被反應板,抗原組成一般包括P24、gp 36、gp41、gp120,能同時檢測 HIV-1,HIV-2型,其特異性較第 1代試劑有了很大的提高。1992年美國研究出第 3代試劑,使用雙抗原夾心法檢測抗體,進一步提高了敏感性;另外,由于第 3代試劑能同時檢出 IgM抗體,因此可以縮短窗口期,但仍存在漏檢的問題。第 4代試劑,則在第 3代的基礎上進一步增加了 P24抗原的檢測,把H IV抗原和抗 P24的抗體同時包被反應板,同時檢測血清中的 HIV抗體和 P24抗原,進一步縮短“窗口期”。與第 3代試劑相比,第 4代試劑檢測窗口期平均縮短 4～5 d。

2.2 確認試驗 包括免疫印跡試驗(WB)、條帶免疫試驗(LIATEK H IVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(RIPA)及免疫熒光試驗(IFA)。國內常用的確認試驗方法是 WB,其中最早出現的條帶是 P24或 gp 160。WB有直接使用病毒裂解物作為抗原的,也有使用重組抗原和合成肽的。HIV特異性抗體檢測 EIA(高敏感性),加上 WB(高特異性),診斷的準確率 ＞99%,假陽性率約為 0.0006%,造成錯誤診斷的機會幾乎是“0”[4]。

3 P24抗原檢測

機體感染 HIV后,P24抗原是較早能從血清中檢出的病原學標志,感染后 2～3周即可檢出,1～2個月左右進入抗原高峰,然后隨著抗體的產生形成抗原抗體復合物,由于抗體的中和作用,P24抗原濃度下降至難以測出的水平。進入無癥狀期,HIV抗體持續陽性。從機體感染 HV到產生相應抗體的這段時間叫窗口期,一般 1～9個月,平均 2～3個月,但 95%以上HIV-1感染者產生抗體的時間是在感染后 6個月以內[5]。抗原在血清抗體陽轉前 2～18 d即可檢測到,H IVP24抗原檢測主要是作為 HIV抗體檢測窗口期的輔助診斷。通常采用夾心法EIA,即將純化的已知抗體包被在固相反應板孔底,當加入待測血清后,若血清中含有 P24抗原則與包被抗體形成抗原-抗體復合物。再加入酶(HRP)標記的HIV抗體,在抗原上又結合了酶標記的抗體,加底物顯色后,在酶標儀上讀結果。近年來為了提高檢測血清中 P24抗原的敏感性,將血清中免疫復合物解離(ICD)后再進行測定,發展了 ICDP24抗原測定試劑,用于H IVP24抗原測定。

4 HIV核酸檢測

H IV核酸檢測有定性和定量 2類,前者用于HIV感染的輔助診斷,后者常用于監測HIV感染者的病程進展和抗病毒治療效果。HIV核酸定性檢測通常使用 PCR或逆轉錄 PCR(RTPCR)技術,使用分子生物學實驗室通用的基因擴增試劑,引物可來自文獻或自行設計,應盡量涵蓋所有的或常見的毒株,也可使用復合引物。H IV RNA定量測定(病毒載量測定)方法有逆轉錄 PCR試驗(RT-PCR)、核酸序列擴增試驗(NASBA)、分枝 DNA雜交試驗(bDNA)和熒光實時 PCR技術等。

最近,熒光實時定量 PCR(FQ-PCR)檢測技術的應用使PCR的發展進入到一個新境界。傳統的 PCR是擴增后進行終點(end point)檢測,而熒光實時 PCR則可以進行實時(real time)檢測,改變了傳統的電泳終點檢測,可以進行實時監控,得到相應的 S型擴增曲線。不但可以進行定性檢測,更重要是可以進行定量檢測,樣品中待測DNA/RNA拷貝數越高,則 S型擴增曲線出現越早,若有已知拷貝數的標準品,則可以得到未知樣品的拷貝數。美國 PE公司于 1996年發明 Taqman技術,已廣泛應用于基因檢測。熒光實時 PCR檢測技術的應用,使得血漿病毒載量的測定方法在原來的 RT-PCR、分支DNA技術(bDNA)、核酸序列擴增系統(NASPA)基礎上,又增加了一種新的方法。該方法可以檢測血漿病毒載量,也可以檢測血液中單個核細胞的前病毒載量。一般來說,前病毒載量與血漿病毒載量是平行的,具有相關性[6]。但是,經過高效抗逆轉錄病毒高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)治療后,血漿病毒載量可能檢測不到,前病毒載量依然可以檢測到。前病毒載量,也應該成為一個評價 HAART的指標。

5 CD4+和CD8+T淋巴細胞檢測

計數CD4+和CD8+T淋巴細胞的數量,是以細胞內P24抗原作為標志,運用流式細胞儀對 P24抗原陽性細胞進行計數。在T淋巴細胞分類中,CD4+代表T輔助細胞,CD8+代表抑制細胞和 T殺傷細胞。HIV感染人體后的主要靶細胞是CD4淋巴細胞(也累及其他細胞)。隨著病情的演變,HIV復制加快,尤其在AIDS臨床階段,其在淋巴結中每天復制可達 100億左右,且大量釋放到血循環中,使更多的免疫細胞與其他細胞被感染,引起每天破壞的細胞數以百萬統計。大量細胞的破壞,使CD4淋巴細胞數急劇下降,使免疫系統嚴重被破壞。一般認為在疾病早期 CD4淋巴細胞 ＞0.5×109/L,中期為(0.2～0.5)×109/L,晚期則為(0.05～0.2)×109/L,而臨終期可 ＜0.05×109/L。盡管CD4淋巴細胞數不一定能和病毒載量相吻合,但確實是估計病情、預后,以及開始治療的指征之一。在測定CD4淋巴細胞時,一般同時測定CD8淋巴細胞,一方面可以了解 CD8淋巴細胞的變化情況,另一方面兩者的比值也是很重要的疾病嚴重程度的指標。CD4/CD8比例通常為 2∶1,但變化很大(1∶1～3∶1)。若比值 ＜1則意味著免疫狀況不佳,比值越低,則細胞免疫缺陷越重。

6 HIV細胞培養

常規方法是將患者淋巴細胞與正常人的淋巴細胞共同培養,適當周期培養后測定培養液H IVP24抗原/RT,進而判斷患者的淋巴細胞是否受到 HIV感染。細胞培養與血清學方法相比,專一性很強,不會出現假陽性。但其敏感性不如血清學或PCR,因為必須有一定數量的感染細胞存在才能培養出病毒來。培養初期,隨著活化細胞(CD25細胞)的迅速增加,此時被H IV感染的活化T細胞也迅速增殖并復制出大量病毒;培養末期,隨著細胞抗病毒能力的增強(包括細胞的殺傷作用和對抗H IV感染能力的增強)和感染細胞的衰減,血清中病毒載量逐漸降低,可根據這一特點進行培養和增殖毒種。細胞培養方法的最大好處是能得到最原始的臨床毒種,其重要意義在于確認對WB不確定的疑感染者及母嬰傳播、嬰幼兒HIV感染者。毒株可供藥物篩選,耐藥性及其生物學特性等研究。用定量細胞培養法可測定細胞的半數感染單位(TCID50)和半數抑制藥物濃度(IC50),用于抗病毒藥物測定。

體外大量擴增基礎 CD 4/CD 8比值較高的HIV感染者外周血單個核細胞(PBMC)也是可行的,擴增的細胞具備較強的Th1細胞免疫反應能力,在培養晚期具有較弱的 HIV復制能力,這將為艾滋病的免疫細胞治療提供必要的實驗數據,為進一步開展臨床實驗奠定基礎[7]。

7 基因芯片技術的應用

基因芯片技術是近些年發展起來的新興的生物技術,是指將許多特定的寡核苷酸片段作為探針,有規律地排列于固相支持物上,然后與待測的標記樣品的基因進行雜交,再通過激光共聚焦熒光檢測系統等對芯片進行掃描,并配以計算機系統對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測,從而迅速得出所要的信息。目前基因芯片的發展包括以下幾個方面：(1)60～70mer Oligo芯片的應用推廣：研究發現,70mer左右長度的單鏈 DNA片段可以最優化地反映其所代表的基因[8];(2)SNP(Single Nucleotide Polymorphism)芯片的研制：SNP即單核苷酸多態性,指基因組中微小的基因序列差異.SNP譜不僅可用于更精確的個體識別,而且可用于個體疾病易感性的檢測[9];(3)mCGH的應用：CGH即比較基因組雜交,雖然是一個傳統技術,其與 DNA芯片技術結合可形成基因芯片-CGH(microarray,CGH,mCGH)技術,由于可高通量地比對基因組的結構和組成,在腫瘤、新藥研究、藥物敏感性以及新療法的開拓中已開始發揮著重要的作用[10];(4)基因表達譜研究：基因表達譜 (gene expression p ro file)研究可以高通量地檢測基因表達信息[11];(5)疾病診斷用基因芯片。

基因芯片技術以其高通量、快速檢測的特點,在基因表達、腫瘤診斷、遺傳病診斷、基因分型等諸多領域得以廣泛應用。在 HIV檢測方面,Affymetrix公司開發出 Gene Chip HIV PRT 440芯片,用于抗H IV逆轉錄酶和蛋白酶藥物的耐藥性分析。對B亞型的檢測結果很好,但對非B亞型的耐藥性檢測存在漏檢和錯檢。

雖然基因芯片技術尚需要進一步完善,但是可以預見,在未來的幾年里,其應用前景是好的。其不僅可用于HIV的耐藥性檢測和的基因診斷,甚至可以把許多致病病原體的基因集中在一張芯片上,用一張小小的芯片就可以同時對許多微生物的感染進行診斷,這不久將成為現實[2]。

綜上所述,本文從抗體、抗原、病毒、T細胞計數、細胞培養及基因芯片技術等綜述了 H IV/AIDS實驗室檢測研究進展。隨著分子生物技術的飛速發展,基因芯片技術的應用,HIV/AIDS的實驗室檢測正朝著快速、敏感、準確、自動化方向發展。相信不久的將來,會有更多的新技術被應用到這一領域。

1 李素敏,王潤田,趙云珠.輸血相關 HIV感染的免疫學檢測進展.中國輸血雜志,2004,17：204-206.

2 魏民,邵一嗚.HIV實驗室研究進展和發展趨勢.國外醫學病毒學分冊,2003,10：65-69.

3 Weber B,Guttler L,Thorstensson R,et al.Human immunod-eficiency virus's screening assay.JClin Microbiol,2002,40：1938-1946.

4 Suligoi B,Calli C,Massi M,et al.Diagnosis and prevention of AIDS.J Clin Microbiol,2002,40：4015-4020.

5 約翰 G,巴特利特,喬爾 E,等主編.邵一鳴,蔣巖,欒文民,譯.艾滋病病毒感染的診斷與治療.第 1版.北京：科學出版社,2002.1-23.

6 O'Doherty U,Swiggard WJ,Jeyakumar D,et al.Detection early for A IDS infection.JVifol,2002,76：10942-10950.

7 張政,趙敏,聶為民,等.人類免疫缺陷病毒-1感染者外周血單個核細胞體外培養的免疫學及病毒學特點.中華醫學雜志,2005,85：1039.

8 Wei M,Ma WL,Zhang B.Oligonucleotide rnicroarray with RD-PCR labeling technique for detection and typing ofhuman papillomavirus.Curr Microbiol,2006,52：204-209.

9 Makedon WY,Pearlman J.Tumor classification based on DNA copy number aberrations determined using SNP ar rays.Oncol Rep,2006,15：1057-1059.

10 U rzua U,Frankenberger C,Gangi L,et al.M icroarray comparativegenomic hybridization profile of amurinemodel for epithelial ovarian cancer reveals genom ic im balances resembling human ovarian carcinomas.Tumour Biol,2005,26：236.

11 Carcel-Trullos J,Stanley JS,Saha R,et al.Characteriza tion of the glycosylation profile of the human breast cancer cell line,MDA 2231,and a bone colonizing variant.Int JOnco,2006,28：1173-1183.

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252600 山東省聊城市第二人民醫院檢驗科

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