HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在宮頸病變組織表達的意義

羅遠材，瞿全新，糜若然

（1.天津醫科大學一中心臨床學院婦產科，天津 300192；2.天津醫科大學總醫院）

臨床實踐發現，隨宮頸病變程度增加，HPV感染的檢出率增加，尤其在宮頸癌患者，應用PCR的方法，HPV的檢出率甚至接近100%。PKR→p-PKR→p-EIF2α傳導通路作為機體抵御病毒感染的重要防線，其在HPV感染狀態下能否被有效激活及PKR、p-PKR、p-EIF2α表達水平與宮頸病變級別、宮頸癌患者預后的相關性仍不明確。本研究通過檢測HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α在宮頸病變組織的表達情況，闡明彼此之間的相互關系，在宮頸癌發生、發展中的作用及對宮頸癌患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2004年3月～2008年6月在天津市第一中心醫院、天津醫科大學總醫院因宮頸病變行開腹手術或宮頸活檢、錐切的存檔病理石蠟塊177例及其完整的病例資料。177例中宮頸癌63例，包括鱗癌55例，腺癌8例，年齡21～76歲，平均（50.7±18.6）歲。FIGO分期：Ⅰ期13例（Ⅰa24例、Ⅰb15例、Ⅰb24例），Ⅱ期34例（Ⅱa13例、Ⅱb21例），Ⅲ期13例（Ⅲa2例、Ⅲb11例），Ⅳ期3例（Ⅳa1例、Ⅳb2例）；癌細胞分化程度：高分化24例，中低分化39例；原發瘤直徑≤4cm 47例，＞4cm 16例。宮頸CINⅠ39例，年齡20～56歲，平均（34.1±10.8）歲。CINⅡ35例，年齡21～57歲，平均（37.6±13.2）歲。CINⅢ40例，年齡25～75歲，平均（41.2±11.7)歲。另收集因良性病變行子宮切除的正常宮頸組織15例。所有標本均經經驗豐富的高年資病理醫師診斷證實。

1.2 試劑與方法

知識產權的基本理念與反不正當競爭擴展保護之限度——兼評“金庸訴江南”案 .....................................王太平 10.03

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人PKR單克隆抗體購自美國R&D Systems公司，小鼠抗人HPV(16/18)E6單克隆抗體、兔抗人p-PKR（Thr446）、兔抗人p-EIF2a（Ser51）多克隆抗體購自美國Santa Cruz生物公司，SP-9001、SP-9002免疫組化染色試劑盒、ZLI-9032濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物公司，陽性切片由天津市第一中心醫院病理室提供。

2.3 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α表達與宮頸癌患者預后 宮頸癌Ⅰa2～Ⅱa期患者先行手術治療，后輔以放療或放化療結合治療；Ⅱb期及以上患者行放療或放化療結合治療。63例宮頸癌患者在門診接受隨訪，檢查內容包括血常規、婦科檢查、腹腔盆腔彩超、胸片等，必要時檢查腫瘤標記及盆腔CT。隨訪3～42個月，病情進展（患者因病死亡或臨床癥狀加重，腫瘤標記物升高，腫瘤體積增大或出現新的轉移灶、新的淋巴結轉移等）31例，Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期14例；其中死亡12例，Ⅰ～Ⅱ期3例，Ⅲ～Ⅳ期9例。經卡方檢驗，Ⅲ～Ⅳ期病情進展率高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.01）。HPV（16/18）E6表達陽性者病情進展率高于其表達陰性者（P＜0.05），p-PKR、p-EIF2α表達陽性者病情進展率低于其表達陰性者（P＜0.05，P＜0.05），見表3。

2.1 宮頸各級別病變組織中HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2a的表達 HPV（16/18）E6在宮頸癌組的陽性表達率高于正常宮頸組及CINⅠ組（P＜0.01，P＜0.05），與其余各組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；PKR在宮頸癌組的陽性表達率高于正常宮頸組及CINⅠ、Ⅱ組（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），與CINⅢ組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；p-PKR蛋白在正常宮頸、CINⅠ-Ⅲ、宮頸癌的陽性表達率分別為6.7%、15.4%、20.0%、15.0%、15.9%，各組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；p-EIF2α在CINⅢ組的陽性表達率高于正常宮頸組（P＜0.05），與其余各組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；在宮頸癌組，PKR的陽性表達率顯著高于p-PKR（P＜0.01）；HPV（16/18）E6、PKR的陽性表達率與宮頸病變程度成正相關（P＜0.05,P＜0.05），p-PKR、p-EIF2a的陽性表達率與宮頸病變程度無明顯相關性（P＞0.05，P＞0.05），見表1。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件包對所得數據進行統計分析。計數資料采用χ2檢驗，相關比較采用Spearman等級相關進行統計分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

1.3 結果判定 在400倍光學顯微鏡下隨機選取8個視野，每個視野觀察100個細胞，計數陽性細胞，取平均值。將陽性細胞按其染色數量和顯色強度分別評分，兩項相加，0～1分為(－)，2～3分為(＋)，4～5分為(＋＋)，6～7分為(＋＋＋)，(＋～＋＋＋)均為陽性[1]。

1.2.2 方法 將所有病理組織標本的石蠟塊連續切片，厚度約為3～4μm，用APES防脫片膠處理的載玻片撈片后置于60℃的恒溫烤箱內烤片，使組織標本與載玻片緊密粘附。組織切片經脫臘處理后在高溫高壓下進行抗原修復，然后按SP三步法免疫組化染色試劑盒說明書提供的實驗步驟進行操作。TBS代替一抗做空白對照。一抗工作液濃度1∶100。

2 結果

地理國情要素和地表覆蓋數據雖屬2類成果，但它們之間存在必然的邏輯關系。例如，地理國情要素中的道路中心線應位于地表覆蓋道路圖斑面內，地理國情要素中水域的高水界應大于地表圖斑中水面的范圍，地理國情要素中單位院落的點位應位于地表覆蓋數據中房屋建筑的范圍內等。在檢查中，經常發現在此類要素中會出現邏輯約束關系不合理現象。作業時，應重點關注此類要素的聯動更新問題，切勿顧此失彼。

表1 各組患者HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的陽性表達[n(%)]

HPV是一種重要的致瘤病毒，也是宮頸病變患者檢出的最常見病毒之一，其突破機體抗病毒的防御機制持續感染，無疑在宮頸癌的發生及演進過程中起至關重要的作用。Cestero[2]指出：高危型HPV（HR-HPV）持續感染是低級別CIN發展為CINⅢ、甚至宮頸浸潤癌的關鍵因素，單獨一種HR-HPV感染陽性婦女在4年內發展為CINⅢ的危險性為4.3%，10年的危險性>7%，而HR-HPV感染陰性婦女發展為CINⅢ的危險可以忽略不計。因此，HR-HPV是推動宮頸由低級別病變向高級別病變發展并最終導致宮頸癌的最重要因素。

這是美國為重啟本輪對伊朗制裁而設立的臨時性過渡機制，根據是現代法治國家普遍承認的“法無溯及力”的基本原則，即法律一般情況下不應對生效之前相關主體的行為造成不利的后果?！兑晾屎藚f議》第37條中也有類似規定，即締約國在按照《伊朗核協議》的糾紛處理機制（退出《伊朗核協議》并）重啟對伊朗的制裁時，“不得溯及締約國和伊朗之間在《伊朗核協議》生效期間簽署的合同”，前提是這些合同的簽訂和履行須符合《伊朗核協議》和聯合國安理會決議的規定。

表2 宮頸癌患者不同臨床病理特征HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的表達[n(%)]

表3 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α表達與宮頸癌患者預后[n(%)]

3 討論

2.2 宮頸癌患者不同臨床病理特征 HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的表達 腫瘤直徑≤4cm時，HPV（16/18）E6、PKR陽性表達率低于腫瘤直徑＞4cm者（P＜0.05，P＜0.05）；HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2α的陽性表達率在患者年齡、病理類型、癌細胞分化程度、臨床分期等差異無統計學意義（P＞0.05）,見表2。

做為機體防御機制中的重要分子，PKR在細胞生長、分化、凋亡以及抵御病毒感染、抗腫瘤方面均發揮重要的生物學效應。PKR是一種干擾素誘導的dsRNA激活的蛋白激酶，與dsRNA有很高的親和力，激活后表現出抗病毒和抗增殖活性，可作為病毒感染的標志。無活性的PKR是一種折疊鎖樣構型，在病毒復制過程中產生的dsRNA可與PKR結合并誘使其分子構型發生改變，導致多個絲氨酸、蘇氨酸位點自動磷酸化而被激活，其中以第446位蘇氨酸殘基磷酸化最為重要[3-4]。激活的PKR（即p-PKR）能識別并誘使EIF2α第51位絲氨酸殘基磷酸化，磷酸化的EIF2α（即p-EIF2α）增加了對翻譯起始因子EIF2B的親和力，EIF2B是一種EIF2-GDP→EIF2-GTP循環需要的鳥嘌呤核苷酸轉換因子，EIF2α51位絲氨酸磷酸化俘獲了EIF2-GDP和EIF2B形成的復合物，減弱了鳥嘌呤核苷酸轉換因子活性，使EIF2-GTP水平下降，抑制翻譯啟動過程，最終導致蛋白合成完全受到抑制[4]。通過抑制蛋白合成、誘導感染細胞凋亡是PKR抑制病毒復制的主要機制[5]。激活的PKR抑制細胞增殖、通過凋亡損毀細胞；而PKR陰性突變則可促使細胞惡性轉化和腫瘤形成[3]。PKR在組織內的表達受Ⅰ型干擾素調控，被認為是抑制病毒的關鍵靶點和腫瘤抑制劑，是宿主防御機制中發動細胞死亡來對抗病毒感染和腫瘤形成的關鍵點。本文p-PKR、p-EIF2α表達結果及宮頸癌患者隨訪資料顯示：p-PKR、p-EIF2α表達陽性者，病情相對穩定，表明PKR→p-PKR→p-EIF2α傳導通路的有效激活對遏制病情進展有積極作用。

PKR主要定位于細胞質，細胞核內亦有少量表達，但可能與使EIF2α磷酸化無關；細胞質也是PKR被dsRNA激活及使其作用底物EIF2α磷酸化的主要場所[5]。為建立持續穩定的感染，多種病毒進化出一系列不同的機制抑制PKR功能：如產生dsRNA拮抗劑；抑制PKR二聚化；干擾PKR與EIF2α結合；抑制PKR表達或誘導PKR降解等。研究發現：HPV18E6蛋白能通過使p-PKR去磷酸化的方式拮抗PKR對蛋白合成的抑制和其誘導的細胞凋亡，大大削弱了凋亡基因依賴于EIF2α途徑的促凋亡作用[4]。本組數據顯示，隨宮頸病變級別增加，HPV（16/18）E6表達增加，與相關報道一致；而在宮頸高級別病變尤其是宮頸癌組織中，p-PKR、p-EIF2α表達降低，表明PKR、EIF2α明顯激活不足，可能與HPV（16/18）E6高表達抑制PKR、EIF2α磷酸化有關，是導致細胞惡性轉變的關鍵所在。非激活型PKR的表達可受病毒感染、細胞增殖、應激刺激等多種因素影響，本文PKR在宮頸高級別病變組織的高表達可能為宿主細胞受不斷升高的HPV16/18感染及腫瘤細胞增殖負荷等刺激所表現的應激反應，而p-PKR、p-EIF2α呈較低水平表達，應為HPV16/18感染所進化出的自身防御機制使PKR、EIF2α激活障礙或p-PKR、p-EIF2α去磷酸化失活所致，由此導致PKR→p-PKR→p-EIF2α傳導通路不能充分、有效激活。受病毒感染細胞因失去p-EIF2α對其的負調控作用，持續存活，病毒感染擴散，病變細胞惡性轉化，腫瘤組織體積增大，使病變沿著低級別CIN→高級別CIN→宮頸癌的方向發展。由此可見，HR-HPV失活PKR傳導通路的最終結果是使病毒感染擴散，病毒基因有機會整合入宿主細胞基因組內，表達病毒癌蛋白，破壞細胞周期自我調控和凋亡機制，延緩細胞死亡，通過干擾某些致癌或抑癌因子，導致某個細胞克隆發生永生化，并使其有機會積累內在或外在的致癌因子對其的致癌作用，最終發生癌變。

必須努力把握水利現代化建設的正確方向。水利現代化是整個經濟和社會現代化的重要組成部分，水利現代化的過程就是與經濟社會協調、可持續發展的過程。水利為經濟社會現代化發展所提供的保障能力，是衡量一個地區水利現代化建設水平的主要標準。從這個意義上說，水利現代化只有階段性的工作目標，沒有終極性的工作標準。因此，推進水利現代化建設，必須堅持“三個緊緊圍繞”，即緊緊圍繞經濟社會現代化發展戰略，緊緊圍繞農業現代化和新農村建設，緊緊圍繞人民群眾追求幸福生活的新要求，建設符合科學發展要求的水利現代化，建設老百姓想要的水利現代化。

因此，HPV（16/18）E6在宮頸病變組織的高表達會抑制PKR傳導通路激活，促進宮頸病變進展，以致發生宮頸癌，并對宮頸癌患者預后構成負面影響；p-PKR、p-EIF2α能抑制病情進展，改善其預后。

［1］ Betz BL,Strobeck MW,Reisman DA,et al.Re-expression of hSNF5/ InI1/BAF47in pediatric tumor cell leads to G(1)arrest associated with induction of p16ink4a and activation of RB[J].Oncogene, 2002,21(34):5193

［2］ Cestero RM.Risk of high-grade cervical intraepithelial neoplasia (CIN2/3)or cancer during follow-up of human papillomavirus（HPV）infection or CIN1[J].Am J Obstet Gynecol，2006，195(5): 1196

［3］ Su QZ,Wang S,Baltzis D,et al.Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch to full-scale activation of the eIF2α RNA-dependent protein Kinase[J].PNAS,2006,103(1):63

［4］ Kazemi S,Papadopoulou S,Li SY,et al.Control of α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2(eIF2)α phosphorylation by the human papillomavirus type 18E6oncoprotein:implications for eIF2α-dependent gene expression and cell death[J].Mol Cell Biol, 2004,24（8）：3415

［5］ Hakki M，Marshall EE,Niro KLD,et al.Binding and nuclear relocalization of protein kinase R by human cytomegalovirus TRS1[J].J Virol,2006,80（23）：11817