可溶性Aβ25-35對大鼠海馬腦片CA3區神經元延遲整流鉀電流的影響

方 丹 ，劉振宅 ，楊 卓

（1.天津醫科大學生物醫學工程系，天津300070；2.南開大學醫學院）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一種進行性神經退行性疾病，是老年癡呆最常見的原因。AD臨床表現為認知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進行性減退，并有各種神經精神癥狀和行為障礙。AD的確切病因還不清楚，β淀粉樣蛋白（amyloidβprotein,Aβ）增加已被廣泛接受為其中樞病因性過程。Aβ是老年斑的主要成分，是由39~43個氨基酸殘基組成的多肽，其主要神經毒性作用位于Aβ的氨基酸序列25~35[1]。許多研究證實，凝聚態Aβ具有神經毒性作用[2，3]，亦有研究提出，Aβ在纖維性沉積前，即可溶性Aβ也可產生神經毒性作用[4，5]，但其作用機制尚不清楚。海馬是學習記憶的關鍵部位，對衰老變化易感。海馬CA3區與空間辨別性學習記憶關系密切[6]。研究表明，海馬神經元電壓門控性鉀通道與學習記憶密切相關[7]。對急性分離的海馬神經元電壓門控性鉀電流的記錄已有許多報道[8]，在腦片上記錄全細胞電流更接近生理狀態。因此，本研究采用膜片鉗技術觀察可溶性Aβ25-35對大鼠海馬腦片CA3區神經元IK的影響，探討可溶性Aβ25-35的神經毒性作用機制，為研究Aβ25-35與AD發病關系提供實驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，鼠齡9~10 d，雌雄不限，由中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心提供。

N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、已二醇-雙（己-氨基乙基）四乙酸（EGTA）、三磷酸腺苷鎂鹽（Mg-ATP）、河豚毒素（TTX）、4-氨基吡啶（4-AP）、氯化四乙銨（TEA-Cl）、Aβ25-35均為 Sigma 公司產品。其余試劑為國產分析純。

孵育液（mmol/L）：NaCl 125、KCl、NaH2PO41.25、MgCl21.3、CaCl22.4、NaHCO326、glucose 10，pH 用NaOH調至7.3。

電極內液 （mmol/L）：KCl117.5、MgCl22、HEPES 10、EGTA 5、Mg-ATP 2，pH 用 KOH 調至 7.3。

可溶性Aβ25-35溶液的配制：用超純水配制成0.2mmol/L的母液，分裝在安道夫管中，-20℃冷凍備用，實驗時稀釋到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬腦片的制備 參照文獻[9]的方法并在此基礎上加以改進：無菌條件下迅速將大鼠斷頭取腦，置于混合氣（95%O2/5%CO2）飽和的冰冷（0~4℃）孵育液中約5min。將整個腦組織于冰盒上冠狀切除小腦和大腦的前半部分,大腦后半部分用502膠垂直粘貼于振動切片機 （Leica,VT1000S）標本托上，在 0 ℃通混合氣（95%O2/5%CO2）條件下,用振動切片機將腦組織切成350μm厚的冠狀腦片，置于混合氣飽和的孵育液中，室溫（22~25℃）孵育1h備用。

1.2.2 膜片鉗全細胞記錄 玻璃微電極由PIP5型電極拉制儀（HEKA，德國）分兩步拉制，充灌電極內液后阻抗為4~8MΩ。正置顯微鏡下選大鼠海馬CA3區神經元細胞線行盲法全細胞記錄。當電極尖端與細胞膜形成高阻封接（大于1GΩ）后，負壓破膜，使電極內液與細胞內液相通，形成全細胞記錄模式。濾波頻率：2.9 kHz。采樣頻率：10 kHz，采樣數據由Pulse軟件自動記錄，存儲于計算機硬盤內。

在培養皿的孵育液中加入TTX、CdCl2和4-AP，終濃度分別為1μmol/L、0.3mmol/L和5mmol/L。電壓鉗模式下保持電位-70mV，給予-50mV至+90mV的階梯去極化脈沖刺激，步幅+10mV，波寬100ms，頻率0.5 Hz，記錄正常生理狀態下大鼠海馬腦片CA3區神經元的IK；然后將可溶性Aβ25-35母液定量加入到培養皿中，使其達到所需濃度，孵育一定時間后，記錄IK。所有實驗均在室溫（22~25℃）下進行。

1.3 統計學分析 采用Igor5.0和Origin7.5軟件進行統計處理，計量資料以表示。加入可溶性Aβ25-35前后差異的顯著性采用配對t檢驗判定，P＜0.05視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 可溶性Aβ25-35對大鼠海馬腦片CA3區神經元IK的抑制作用 圖 1為加入 1.0μmol/L可溶性Aβ25-35前后記錄的大鼠海馬腦片CA3區神經元IK波形。A為加入Aβ25-35前記錄的IK波形。B為加入Aβ25-3519min后記錄的IK波形。膜電位+90mV時，可溶性 Aβ25-35使 IK峰值降低了（50.21±5.09）%。

2.2 可溶性Aβ25-35對IK作用的劑量-效應關系 圖2為加入 1.0μmol/L、2.5μmol/L和 5.0μmol/L Aβ25-35后IK抑制率直方圖。從圖中看出，加入3個濃度的Aβ25-35后，對IK抑制率均在60%左右，無顯著性差異。

2.3 可溶性Aβ25-35對IK作用的時間-效應關系 圖3為加入1.0μmol/L Aβ25-35后IK的時間過程曲線。從圖中看出，IK隨Aβ25-35加入的時間延長而逐漸減少。加入Aβ25-3523min后，IK趨于穩定。

2.4 可溶性Aβ25-35對IKI-V曲線的影響 圖4為加入1.0μmol/LAβ25-35前后IK的I-V曲線。表1為加藥前后不同電位時IK峰值。從圖4看出，加入Aβ25-35后，IK的I-V曲線逐漸降低，降低的幅度隨去極化加強而增加，呈一定的電壓依賴性。

表1 加入可溶性Aβ25-35前后不同電壓下IK峰值對照表( ，n=8)

表1 加入可溶性Aβ25-35前后不同電壓下IK峰值對照表( ，n=8)

與對照組比，*P<0.05，**P<0.01

加藥前（pA）9.91±5.08 11.72±3.81 21.22±5.35 36.01±1.22 107.01±27.21 203.04±59.44 353.20±66.81 493.21±52.29 620.23±39.56 710.36±65.21 837.28±91.12 947.21±99.14 1040.39±93.19 1170.21±99.21 1314.44±57.29加藥后（pA）7.81±1.20 8.22±5.70 20.51±6.14 35.12±15.52 98.21±13.54 168.13±31.53 280.31±61.62 375.21±29.21 465.47±41.21*532.36±55.01*612.24±26.31*661.36±29.23*710.26±29.51**783.36±41.32**820.01±43.63**膜電位（mV）-50-40-30-20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2.5 可溶性Aβ25-35對IK激活動力學特性的影響 利用公式G=I/（V-VK）將IK的電流值轉換為電導值，式中G為電導，V為膜電位，VK為翻轉電位。以電導值與最大電導值的比值（G/Gmax）對應膜電位繪制出加入Aβ25-35前后IK的激活曲線，所得曲線用Boltzmann方程 G/Gmax=1/{1+exp[-（V-Vh）/k]}進行擬合，式中Vh為半數激活電壓，k為斜率因子。圖5為加入5.0μmol/LAβ25-35前后IK的激活動力學曲線，從圖中可以看出，加入Aβ25-35前后IK的激活動力學曲線均呈S形，加入Aβ25-35后激活動力學曲線顯著左移。加入Aβ25-35前后IK半數激活電壓Vh分別為 （5.88±0.67）mV 和（-2.81±0.76）mV（P＜0.05）；斜率因子k 分別為（18.58±1.63）mV 和（17.73±1.54）mV（P>0.05）。

3 討論

電壓門控性鉀通道廣泛分布于海馬神經元，在調節神經元興奮性等生理功能中起重要作用。IK是動作電位復極化過程的主要成分，影響動作電位的幅度、時程、發放頻率和鈣內流等[10]。本研究顯示，可溶性Aβ25-35對大鼠海馬腦片CA3區神經元IK具有明顯抑制作用，且呈時間依賴性和電壓依賴性，但未表現出明顯的濃度依賴性，分析可能與實驗選擇的濃度范圍有關。有分析認為，可溶性Aβ25-35對IK抑制作用的一個可能的機制是可溶性Aβ25-35使大鼠海馬CA3區神經元IK通道的數量減少；另一個可能的機制是可溶性Aβ25-35對大鼠海馬CA3區神經元IK通道的激活門控產生了靜電和/或變構的影響，改變了IK通道的特性[11]。本研究結果中，激活曲線左移，激活過程提前，使電流增大，說明可溶性Aβ25-35改變了IK通道的特性。但尚有研究顯示，可溶性Aβ25-35對大鼠海馬CA3區神經元IK通道亞型Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1的mRNA的表達有較明顯的抑制作用[12]，說明延遲整流鉀通道的數量減少，從而使電流減小。因為總的結果是可溶性Aβ25-35使延遲整流鉀電流減小。因此，我們分析，可溶性Aβ25-35對IK的作用很可能是以上兩種機制并存的。

由于延遲整流鉀電流是細胞膜復極化的主要成分，控制神經元的Ca2+穩態和興奮性，因此，可溶性Aβ25-35對大鼠海馬腦片CA3區神經元IK的抑制導致動作電位時程延長以及靜息膜電位下降，從而促進細胞外Ca2+向細胞內流動，Ca2+無限制地內流將導致Ca2+超載，從而促進脂質過氧化和自由基的產生，增加細胞對氧化應激和興奮性毒素的敏感性，加劇細胞損傷；同時，Ca2+超載也會損傷氧化磷酸化，導致神經細胞能量不足，從而引起細胞功能紊亂甚至死亡[13]。此外，Ca2+穩態被破壞還影響淀粉樣前體蛋白（amyloidβ protein precursor,APP）的代謝，使有神經保護作用的可溶性產物sAPPα的產生減少，Aβ產生增多，從而導致惡性循環[14]。因此，可溶性Aβ25-35對大鼠海馬CA3區神經元IK的抑制作用可能是其產生神經毒性作用的機制之一。

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