體外循環對血小板 CD40L表達的影響

龔琪 談凌凌 林薇 王哲 徐振海

體外循環對血小板 CD40L表達的影響

龔琪 談凌凌 林薇 王哲 徐振海

目的 研究體外循環(CPB)過程中血小板膜表達CD40L的變化,及其與血小板激活、全身炎癥反應及凝血變化的聯系。方法 CPB心內直視手術患者 40例,分別于麻醉誘導后 10min(T1)、CPB后 30m in(T2)、CPB停機即刻(T3)、CPB后 2h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取外周動脈血,測定血漿 TNF-α濃度、血小板表面CD 40L和 CD 62P表達,計算術后 24 h縱隔引流量。結果 T2時 CD 40L較 CPB前明顯升高(P＜0.01),T3時達到峰值,T6時恢復到T1水平。血小板 CD 62P表達、血漿腫瘤壞死因子-α的峰值、術后 24 h引流量均和CD 40L表達呈正相關(r=0.610,P＜0.01)。結論 CD40L是隨著CPB對血小板的激活而表達的,CD 40L可能是聯系炎性反應和凝血異常這兩個導致CPB術后主要并發癥的一個重要環節。

體外循環;血小板;CD40L;并發癥

體外循環(cardiopulmonary bypass,CPB)激活血小板引起機體的炎性反應以及凝血功能的變化是心臟外科手術術后出血、栓塞、心肌損傷、多器官功能衰竭等一系列并發癥的病理基礎[1],但其機制尚未完全闡明。CD 40L作為由血小板表達又和炎癥、凝血有關的一種蛋白,當某種條件下血小板被激活后,迅速表達于血小板表面,并可和其裂解生成的血漿可溶產物sCD 40L(Soluble CD 40L)共同發揮生理作用,體內的CD40L主要來源于血小板[2]。本試驗通過檢測行心內直視手術患者在CPB前后多個時間點血小板膜表達CD40L和血小板激活標志物 CD 62P的情況、血漿中的炎性反應標志物腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度及患者術后 24h縱隔引流量來探討 CPB對血小板表達 CD 40L的影響,CD 40L和血小板激活標志物 CD 62P、炎性反應標志物 TNF-α、術后出血量的關系,從而對 CPB過程中血小板CD40L的表達規律以及其與CPB引起的炎癥、凝血異常的關系做探討,為更有效的減少CPB并發癥從而提高手術效果提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2006年 1至 12月在我科住院行心內直視手術的房室水平左向右分流的先天性心臟病(先心病)患兒40例,其中男 26例,女 14例;年齡 7個月 ～13歲,平均年齡(2.1±1.8)歲;體重 7～28 kg,平均體重(13±8)kg;病種為室間隔缺損 31例,房間隔缺損 9例;以上病例均無伴發血液系統、肝腎等系統疾病,術前無感染及免疫系統異常,無非甾體類抗炎藥、激素、免疫調節劑用藥史。麻醉誘導予以氯胺酮、芬太尼,均采用氣管插管靜脈及吸入復合麻醉,麻醉維持予以芬太尼、異丙酚和安氟醚。所有患兒均采用胸骨正中切口,常規主動脈及上下腔靜脈插管建立 CPB,采用美國 Sarns-8000人工心肺機,美國Dideco膜式氧合器和寧波菲拉爾微栓過濾器。血定安、復方氯化鈉溶液預充,轉機前肝素化抗凝(3 mg/kg),CPB中追加肝素,保持激活全血凝固時間(ACT)＞480 s。血液中度稀釋,淺中度降溫。動脈流量 80～150ml?m in-1?kg-1,CPB中維持平均動脈壓 40～60mm Hg(1mm Hg=0.133 kPa)。改良 St.Thomas晶體心肌保護液間斷主動脈根部灌注。停機后按1∶1用量以魚精蛋白中和肝素。術后根據病情輸去白懸浮紅細胞和新鮮冷凍血漿,全組患者未出現死亡及二次開胸止血的情況。升主動脈阻斷時間 13～68min;平均(28±13)m in;CPB時間 36～115m in,平均(49±26)m in。

1.2 標本采集與指標檢測 分別于麻醉誘導后 10 min(T1),CPB后 30m in(T2),CPB停機即刻(T3),CPB后 2 h(T4)、4 h(T5)、8h(T6),抽取橈動脈血。分別予以 CD 62P單克隆抗體(美國PHARMINGEN公司),CD 40L單克隆抗體(美國 Ancell公司)標記血小板后加入熒光二抗,采用流式細胞分析技術上機(美國 BD公司 FACS420型流式細胞儀)各檢測 20 000個血小板,利用HP-300Consort 30計算機細胞分析軟件計算平均熒光強度(MFI)進行資料采集和分析。采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(美國 RB公司)應用意大利西亞克公司的ALISAI酶免自動分析儀,測量血清 TNF-α。于術后24 h統計患者縱隔引流總量,結果以每千克體重出血毫升數(ml/kg)表示。

1.3 統計學分析 應用 SPSS 12.0統計軟件,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析和Pearson直線相關分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

T2血小板膜表達 CD 40L已比 CPB前明顯升高(P＜0.01),在 T3時達到峰值,隨后開始下降,T6時恢復到 CPB前水平(P＞0.05)。CD62P在 T2時明顯升高(P＜0.01),在 T3時達到峰值,T6時回到基線水平(P＞0.05),在CPB前后所測定的幾個時間點上,它的表達量和相同時間點的 CD 40L均呈正相關 (r值 分別為 0.563、0.657、0.691、0.580、 0.575和0.448,P＜0.05)。血漿 TNF-α在 CPB后開始升高,T3時達到峰值,與T1比差異有統計學意義(P＜0.01),隨后開始下降。TNF-α峰值與 CD 40L峰值呈正相關(r=0.577,P＜0.01)。術后 24h縱隔引流量為 4.88～15.46m l/kg,平均(9.7±2.7)m l/kg;24h縱隔引流量和 CD 40L峰值呈正相關(r=0.610,P＜0.01)。見表 1。

表1 CPB中不同時間血小板膜表達CD 40L和CD62P與血漿TNF-α濃度比較n=40,±s

表1 CPB中不同時間血小板膜表達CD 40L和CD62P與血漿TNF-α濃度比較n=40,±s

注：與T 1比較,＊P＜0.05,#P＜0.01

項目 T1 T 2 T3 T4 T5 T6 CD40L(MFI) 1.8±0.4 4.3±0.9＊ 6.5±1.6# 5.7±1.4# 4.5±1.2# 1.9±0.4 CD62P(MFI) 1.6±0.4 3.8±0.8# 5.6±1.3# 5.1±1.2# 3.9±0.8# 1.7±0.3 TNF-α(pg/m l) 4.5±0.3 9.2±1.1＊ 16.9±1.2# 15.6±1.2# 13.9±1.1# 12.8±1.0

3 討論

CD40L是一種跨膜糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子家族,研究表明人體內 CD 40L及其血漿可溶產物sCD 40L的來源主要為激活后的血小板[2-4]。血小板活化后其顆粒內容物之一的 α顆粒膜與血小板質膜融合并迅速在血小板膜表面上大量表達的 CD 62P是血小板活化的特異標志[5]。血小板激活是體內多種復雜條件互相影響、互相聯系的一個結果,CD 62P和 CD40L存在位置和激活條件不同,所以不同條件下血小板被激活后表達時間、表達量和方式可能有差異[6]。CPB是一種非生理環境下的治療手段,引起大量的血小板激活[7]。本試驗中 CPB時CD62P的表達在時間規律上和 CD 40L完全相同,在幾個時間點上直線相關分析均呈正相關(P＜0.05)。說明 CPB由于異物表面、剪切力等原因引起的由 CD62P代表的血小板激活和CD40L的外化過程幾乎是同步進行的,且這種過程一直持續到術后早期。所以我們認為 CPB時血小板膜 CD40L可以和CD62P一樣作為血小板一種標志物而反映血小板的激活情況。

CPB時血液的破壞、缺血再灌損傷、手術創傷、補體激活、內毒素釋放等原因致使體內大量炎性介質的釋放導致全身炎性反應,這是CPB術后一系列并發癥包括多器官功能衰竭的病理基礎[8]。TNF-α是一種主要由單核巨噬細胞分泌的細胞因子,可以由于CPB而大量釋放從而介導炎性反應,且其與血漿中 TNF-α的水平呈正相關(P＜0.01),可通過監測血漿中TNF-α水平來間接反映全身炎癥狀況的程度[9]。本研究中發現 TNF-α峰值與 CD40L峰值之間呈正相關關系(r=0.577,P＜0.01),說明 CD 40L并不僅僅是血小板激活的標志物,可能對于 CPB術后全身炎性反應起作用,而且也可以象 TNF-α一樣對 CPB所導致的全身炎性反應、術后的并發癥作出一定的預測,這為研究CPB引起的全身性炎癥、血栓反應的機制及有針對性的采取治療措施提供了一個新的思路。CD 40L或 sCD40L通過結合血小板自身表達的GPⅡb/Ⅲa從而引起血小板聚集,是穩定血小板血栓和導致血小板自身激活的活性物質[10]。CPB所導致的并發癥除了可由炎性反應引起外,還有很大一部分是由于凝血功能異常所導致,所以CPB圍術期的腦損傷、心肌損傷可能也與此有關,而且由于血小板數量減少和功能異常引起術后出血。本研究中發現 CD 40L峰值和 24h引流量呈正相關關系(r=0.610,P＜0.01),從而我們推測CPB導致血小板激活引起的凝血功能障礙中 CD 40L可能是其中一個環節,其部分作用是通過 CD 40L和血小板互相作用來實現的。

我們的研究則描述了CPB過程中CD40L的動態變化并初步揭示了其和 CD 62P代表的血小板激活之間聯系,而且還發現 CPB中血小板表達 CD40L的高低和全身炎性反應標志物TNF-α及術后縱隔引流量都呈正相關關系(P＜0.01),說明血小板可能就是通過 CD40L系統成為聯系這兩個過程的紐帶,對它深入研究將對理解CPB導致機體損傷的病理生理學機制,從而為有針對性的采取更好的措施預防和治療 CPB引起的出血、炎癥并發癥,提高手術效果和安全性起到積極的作用。但本試驗僅從大體上作了CPB對血小板激活引起CD40L的表達規律及其和 CD 62P、TNF-α、術后出血量的關系分析,并未在更深入的層次上研究它們的相互作用關系及其機制。而且出于對誤差控制的考慮,選取的病例病種較為單一且病情較輕。

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The effect of cardiopu lmonary bypass in the exp ression o f CD 40 ligand on p lateletmembrane

GONG Qi, TAN Lingling,LINWei,eta l.Departmentof Thoracic and Cardiovascu lar Surgery,The Fourth Hospital of HebeiMedical University,Shijiazhuang 050011,China

Objective To observe the effect of cardiopulmonary bypass(CPB)in the expression of CD40 ligand(CD40L)on p lateletsmembrane,and to investigate the correlation between platelet stimulation,systemic inflammation and coagulation.M ethods 40 patients undergoing open heart operation by CPB were studied.Blood samp leswere collected from peripheral arterial 10 minutes after anesthesia induction(T1),30minutes after CPB(T2),instant on the termination of CPB(T3),after 2 hours(T4),4 hours(T5),8 hours and at the term ination of CPB(T6).The expression of CD 40L and CD 62P on plateletmembrane,plasma TNF-αconcentration,totalamount of bleeding after 24-hour CPB were detected.Resu lts The expression levels of CD 40L on plateletmembrane were significantly increased after CPB(P＜0.01),which reached its peak at the term ination of CPB and returned to the baseline after 8 hours.The CD 40L was significantly correlated with CD 62P,TNF-αand the amount of bleeding respectively(P＜0.01).Conclusion The expression of CD40L on plateletmembrane increaseswith the p lateletactivation caused by CPB.The platelet-derived CD 40Lmay be involved in both the thrombotic and inflammatory events accompanied with CPB.

cardiopulmonary bypass;p latelet;CD 40L;comp lications

R 654.1

A

1002-7386(2010)07-0797-03

050011 石家莊市,河北醫科大學第四醫院胸心外科

2009-12-14)