激光共聚焦技術證實HCV NS5在人胎盤滋養層細胞的定位表達*

聶青和 程勇前 黃曉峰 張亞飛 羅新棟 楊家驥 楊艷紅

自1989年丙型肝炎病毒（HCV）基因組克隆成功后，人們對其基礎、流行病學、臨床診斷和治療的研究已十分深入[1]。HCV感染在全世界估計約1.7億人[2]，HCV在我國一般人群中的感染率約為3.2%。中國約有3700萬～4000萬感染者。丙型肝炎常進展為肝硬化和肝細胞癌。HCV的經典傳播途徑為經血液或血液制品傳播，但1991年后獻血員HCV的篩檢已使輸血后丙型肝炎大為減少[3]。現研究認為HCV存在母嬰傳播[4，5]，在HCV感染的母親中，HCV母嬰傳播發生率大約為5%左右[6，7]，但目前尚無有效的方法阻斷這種傳播。因此，HCV的母嬰傳播將可能成為未來HCV感染的重要途徑[8，9]。丙型肝炎疫苗尚難以用于人體預防HCV感染[10]，因此阻斷HCV母嬰傳播的研究工作顯得十分重要。目前，有關HCV母嬰傳播的研究多數為流行病學調查[11]，關于HCV如何在母嬰間進行傳播的具體機制尚不清楚，可能為宮內傳播、出生時傳播和出生后通過母乳、唾液傳播等，而宮內感染可能是主要機制之一[12，13]。本研究用HCV RNA陽性血清感染體外培養的人胎盤滋養層細胞，并運用激光共聚焦技術觀察人滋養層細胞感染HCV后的特性，探討HCV NS5在滋養層細胞中的定位表達，為進一步深入研究HCV的母嬰傳播分子機制奠定實驗基礎。

材料與方法

一、單細胞懸液的制備 取剖腹產術后的無菌胎盤組織，將絨毛組織剪碎至1～3mm3，以0.25%胰蛋白酶液及 20u/ml DNaseⅠ于 37℃恒溫搖床內消化30min，消化產物經100目不銹鋼篩網過濾后，濾液加入預先加有5ml小牛血清的50ml離心管內，1000rpm離心10min，棄上清，DMEM培養液重懸沉淀。

二、Percoll密度梯度制備 用9.0%NaCl與Percoll以1：9混合，以達到生理性滲透壓，再以0.9%NaCl稀釋為45%和35%兩個濃度，按濃度從大到小將兩個不同密度的Percoll溶液逐層緩慢加入10ml離心管內，每個濃度3ml。Percoll細胞分離液為美國Pharmacia公司產品（No：05-59-16-001A）。

三、細胞的純化與培養 將收集的細胞懸液2ml緩慢加于Percoll分離液上層，以2500rpm離心20min，用吸管小心吸取云霧狀的中層，置于50ml離心管內，DMEM稀釋4倍，1000rpm離心10min，棄上清，以含20%胎牛血清DMEM培養液重懸沉淀，將細胞懸液濃度調整至5～6×109/L，置于培養瓶或預先置有蓋破片的六孔培養板內37℃，5%CO2孵箱內培養。

四、免疫細胞化學染色 將細胞爬片固定后，用ABC法進行細胞角蛋白、波形蛋白染色。胎盤組織切片脫蠟至水后用ABC法進行細胞角蛋白、波形蛋白染色。免疫組織化學染色用ABC試劑盒購自華美生物工程公司，所用抗細胞角蛋白（No：C8541）及波形蛋白抗體（No：MU074-UC）購自寶泰克生物工程公司?？笻CV NS5單克隆抗體購自寶泰克生物工程公司。

五、HCV體外感染試驗 選擇抗HCV陽性血清，HCV RNA 為6.1×107copies/ml，經血清學檢測甲、乙、丁、戊型肝炎病毒標志物均為陰性，另選正常人血清作為陰性對照。以含20%丙型肝炎患者血清的DMEM培養液感染體外培養24h后的滋養層細胞，同時以含20%正常人血清的DMEM培養液作為陰性對照，37℃，5%CO2孵箱內培養24h，倒置顯微鏡下觀察，棄去感染血清，PBS充分洗滌5次后加入新鮮培養液，留取最后一次洗液待檢，以后每2天換液一次，留取培養上清待檢。

六、培養上清HCV RNA定性及定量檢測 為保證試驗的可靠性，分別采用RT-PCR及擴增敏感試驗（Amplisensor assay）對培養上清HCV RNA進行定性及定量檢測，簡言之，定性檢測：提取HCV RNA，加入逆轉錄反應體系，37℃，30min：預變性 94℃，300sec，第一次 PCR 循環，94℃ 45sec，50℃ 45sec，72℃ 45sec循環 35次，終延伸 72℃，300sec；取 2μl第一次循環后的產物加入第二次PCR反應緩沖液23μl；預變性94℃ ，300sec， 第 二 次 PCR 循 環 ，94℃ 45sec，55℃45sec，72℃ 45sec循環 35 次，終延伸 72℃，300sec；取擴增產物15μl加樣于含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，于1×TAE緩沖液中在60v電壓下電泳15～20min。根據試劑盒說明，紫外燈下觀察225bp處有熒光者為陽性；定量檢測：提取HCV RNA，加入逆轉錄反應體系，37℃ ，45min： 預 變 性 90℃ ，2min，PCR 循 環 ，95℃25sec，60℃ 35sec，72℃ 45sec 循環 20 次，終延伸72℃，30sec，10℃保溫 1h；計算機讀取數值，＞102者為陽性。HCV RNA熒光定量檢測試劑盒購自美國Acegene公司。

七、電鏡標本制作及激光共聚焦顯微鏡檢查 細胞培養40d后以0.25%胰蛋白酶分別消化感染組及對照組貼壁生長的細胞，PBS洗滌一次，2000rpm離心20min，4%戊二醛固定過夜，送本校電鏡室。所用激光共聚焦顯微鏡型號為 MRC-1024（BioRad，Watford，UK），固定在含Plan-Ne-ofluar 40x油浸鏡（數值孔徑為 3.53）的顯微鏡（Zeiss，Gena，Germany）上，用多線氬離子激光束（25mW）在488nm激發熒光素（FITC）。這些措施使得在高放大倍數下對微弱的標記物能產生敏銳的熒光信號。共聚焦系統由Bio-Rad公司提供的軟件控制，在IBM計算機上運行。

結 果

一、滋養層細胞體外生長特性觀察 在倒置顯微鏡下觀察，中層細胞以單個核細胞為主，培養3h后開始貼壁，18h后基本全部貼壁，貼壁細胞多呈上皮細胞樣生長，形態多樣，個別細胞呈纖維細胞樣。24h后開始出現多個核細胞，并隨時間推移逐漸增大，成片生長。HCV感染后，感染組及對照組細胞光鏡下觀察未見明顯不同。

二、免疫細胞化學染色結果 細胞爬片染色陽性信號為棕黃色顆粒，結果顯示，90%以上細胞的細胞角蛋白染色陽性，陽性信號定位于細胞漿，而波形蛋白染色僅個別細胞可見陽性信號（圖1，2）。

圖1 滋養層細胞角蛋白表達（免疫熒光染色，×100）

圖2 滋養層細胞波形蛋白表達（免疫熒光染色，×100）

三、免疫熒光染色結果 HCV感染后的滋養層細胞，經抗-HCV NS5染色陽性，陽性信號為黃綠色或黃色熒光，主要定位于細胞核周。正常對照標本的滋養層細胞抗-HCV NS5染色未見黃綠色或黃色熒光，因伊文藍襯染而呈現紅色。

四、激光共聚焦觀察 HCV感染后的滋養層細胞抗HCV NS5染色陽性信號為黃綠色或黃色熒光，主要定位于細胞核周（圖3）。

圖3 HCV感染的滋養層細胞抗HCV NS5陽性（激光共聚焦，×1059）

五、培養上清HCV RNA表達 見圖4和表1。

圖4 培養上清HCV RNA定性檢測結果

表1 培養上清HCV RNA定量和定性檢測結果

討 論

胎盤是胎兒與母體之間進行物質交換的重要器官，由滋養層細胞、毛細血管內皮細胞以及二者之間基膜所構成的胎盤屏障組成，是營養物質以及某些藥物、病毒、激素等從母體進入胎兒的必經之路，而滋養層細胞是胎盤屏障的第一道防線。合體滋養層細胞還具有重要的內分泌功能，體外分離培養滋養層細胞是研究其功能及母體與胎兒之間物質交換的具體分子機制的細胞學基礎[14]。本研究在Kliman等[15]建立的Percoll不連續密度梯度分離純化方法的基礎上作如下改進：將分離細胞的密度梯度簡化為兩層。Kliman等用14個不連續Percoll分離密度梯度進行分離，并確定滋養層細胞在Percoll中所處的密度值為1048～1062g/L，而Cordon等[16]用連續密度梯度觀察其密度值為 1053～1060g/L，以此為依據并根據美國Pharmacia公司提供的Percoll使用說明書中不同稀釋度的Percoll在0.15M（0.9%）鹽溶液中相應的密度值曲線，將分離梯度簡化為兩層，即35%（密度值為1043g/L）與45%（密度值為1062g/L），以使所要分離的滋養層細胞處于兩層之間，這樣既節約了實驗試劑，又簡化了操作步驟。

許多學者研究證實，在胎盤絨毛組織中細胞角蛋白染色陽性的僅為細胞滋養層細胞及合體滋養層細胞[17，18]。本研究培養細胞爬片經免疫組化染色結果顯示，細胞角蛋白染色陽性者占90%以上，證明改進后的分離方法同樣可以得到滿意的分離效果。

目前，HCV感染靶細胞的方式主要有血清直接感染法、脂質體介導法、電穿孔法及真核細胞表達載體攜帶法等[19，20]。直接感染法是HCV感染細胞的主要方法，即把丙型肝炎患者血清直接加到培養細胞中進行感染，37℃溫育不同時間后，更換新鮮培養液，在不同時相檢測細胞及其培養上清HCV RNA。RT-PCR用于直接檢測培養上清及細胞中HCV正鏈及負鏈RNA，可直觀反映HCV在感染細胞中的復制情況。該方法簡便，特異性好，但培養液中殘留的HCV感染物可能會出現假陽性結果。

本研究參照國外學者[21，24]用HCV感染體外培養細胞的方法，對滋養層細胞進行感染試驗。經定性及定量RT-PCR雙重檢測，證明了實驗的可靠性。結果表明，感染前及感染后洗液及對照組中HCV RNA檢測均為陰性，排除了標本來源及HCV感染試驗時培養液中殘留的HCV感染物污染的可能[25，26]。在感染后16天的培養上清中間斷檢測到了HCV RNA。HCV RNA定性檢測結果為陽性的標本HCV RNA定量檢測大于105copies/ml，證實HCV可以感染胎盤滋養層細胞，HCV能否在滋養層細胞中復制尚有待進一步研究。HCV NS5為HCV非結構蛋白之一，目前對其功能研究的較為明確，HCV NS5主要表達RDRP，參與HCV的復制，并具有外周核定位功能，提示HCV的復制位于核周圍的內質網膜上。用抗-HCV特異性McAb NS5，采用間接免疫熒光法直接檢測感染細胞內特異性抗原的表達情況，并用激光共聚焦方法觀察發現，HCV NS5主要在核周表達。感染HCV的人滋養層細胞中存在HCV NS5表達。這些改變為HCV感染滋養層細胞提供了形態學依據[27]，也為進一步深入研究HCV的母嬰傳播分子機制奠定了實驗基礎。

[1]聶青和.加強病毒性肝炎的基礎與臨床研究[J].胃腸病學和肝病學雜志，2007，16：95-99.

[2]COOKE GS，MAIN J.Improving the treatment of hepatitis C infection in the UK[J].Expert Opin Pharmacother，2007，8：183-191.

[3]羅新棟，聶青和，何云，等.檢測抗-HCV IgG κ/λ輕鏈比值及其臨床意義[J].中國醫師雜志，2004，6：32-36.

[4]EUROPEAN PAEDIATRIC HEPATITIS C Virus Network.A significant sex-but not elective cesarean section-effect on mother-to-child transmission of hepatitis C virus infection[J].J Infect Dis，2005，192：1872-1879.

[5]張亞飛，聶青和.HCV垂直傳播的危險因素分析[J].肝臟，2006，11：146-148.

[6]聶青和，周永興，王平忠.丙型肝炎病毒感染孕婦羊水中HCV RNA檢測的臨床意義 [J].中華婦產科雜志，2002，37：19-21.

[7]程勇前，聶青和，周永興.丙型肝炎病毒母嬰傳播機制研究[J]. 世界華人消化雜志，2002，10：445－447.

[8]聶青和，程勇前.妊娠合并乙型肝炎、丙型肝炎的母嬰傳播機制及預防進展（專題筆談）[J].中國實用婦科與產科雜志，2004，20：72-75.

[9]MARTINETTI M，PACATI I，CUCCIA M，et al.Hierarchy of baby-linked immunogenetic risk factors in the vertical transmission of hepatitis C virus[J].Int J Immunopathol Pharmacol，2006，19：369-378.

[10]聶青和，羅新棟.丙型肝炎疫苗研究及面臨的挑戰[J].世界華人消化雜志，2004，12：2405-2409.

[11]SHEBL FM，EL-KAMARY SS，SALEH DA，et al.Prospective cohort study of mother-to-infant infection and clearance of hepatitis C in rural Egyptian villages[J].J Med Virol，2009，81：1024-1031.

[12]張亞飛，聶青和，邵彬，等.丙型肝炎病毒持續感染對體外培養人胎盤合體滋養層細胞生物學性狀的影響[J].醫學研究生學報，2006，19：114-116.

[13]張亞飛，聶青和，邵彬，等.丙型肝炎病毒持續感染對體外培養人胎盤合體滋養層細胞MMP-2和MMP-9合成分泌的影響 [J].第四軍醫大學學報，2006，27：1949-1952.

[14]成令忠.組織學與胚胎學[M].北京：人民衛生出版社，1989：255-259.

[15]KLIMAN HJ，NESTLER JE，SERMASI E，et al.Purification，characterization，and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae [J].Endocrinology，1986，118：1567-1582.

[16]GORDON CD，BARRY FK.Isolation of pure villous cytotrophoblast from term human placenta using immunomagnetic microspheres[J].J Immun Med，1989，119：259-268.

[17]CLARKLARK RK，DAMJANOV I.Intermediate fila －ments of human trophoblast and choriocarcinoma cell lines[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol，1985，407：203-208.

[18]VETTENRANTA K，VON KOSKULL H，HEIKINHEIMO M，et al.Cytoskeletal markers and specific protein production in cells cultured from human first and third trimester placentae[J].In Vitro Cell Dev Biol，1986，22：100-106.

[19]聶青和.丙型肝炎病毒母嬰感染研究及其預防現狀（述評）[J].世界華人消化雜志，2005，13：1257-1262.

[20]程勇前，聶青和，周永興，等.體外感染丙型肝炎病毒的滋養層細胞超微結構變化 [J].中華婦產科雜志，2003，38：28-29.

[21]IACOVACCI S，MANZIN A，BARCA S，et al.Molecular characterization and dynamics of hepatitis C virus replication in human fetal hepatocytes infected in vitro[J].Hepatology，1997，26：1328-1337.

[22]KAITO M，WATANABE S，TSUKIYAMA-KOHARA K，et al.Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study[J].J Gen Virol，1994，75：1755-1760.

[23]CHOO SH，SO HS，CHO JM，et al.Association of hepatitis C virus particles with immunoglobulin：a mechanism for persistent infection[J].J Gen Virol，1995，76：2337-2341.

[24]WATSON JP，BEVITT DJ，SPICKETT GP，et al.Hepatitis C virus density heterogeneity and viral titre in acute and chronic infection：a comparison of immunodeficient and immunocompetent patients[J].J Hepatol，1996，25：599-607.

[25]程勇前，聶青和，周永興，等.人胎盤滋養層細胞的分離培養及IgGFcγRⅢ在人胎盤組織中的表達 [J].醫學研究生學報，2002，15：105-107.

[26]程勇前，聶青和，周永興，等.人滋養層細胞分離培養及HCV體外感染試驗 [J].第四軍醫大學學報，2002，23：1544-1547.

[27]程勇前，聶青和，周永興.丙型肝炎病毒超微結構研究進展[J]. 世界華人消化雜志，2003，11：233-237.