慢性乙型肝炎肝臟微循環障礙發生發展機制的研究

李志群 張 豐 祝 揚 趙景民 潘 登 楊建法 趙雨來

慢性乙型肝炎（CHB）患者肝組織可出現不同程度的微循環障礙。迄今為止，有關CHB肝內微循環障礙的分子機制尚未明確。為此，我們選擇CHB和肝硬化患者的穿刺肝組織，進行α-SMA、環氧化酶（COX1）、COX2、AngII及 AT1 蛋白分子的表達狀況研究，以探討其與肝內微循環障礙發生的關系。

材料與方法

一、材料來源 選取2000年～2004年期間解放軍302醫院收治的經臨床和病理診斷的慢性乙型肝炎和肝硬化患者肝穿刺標本120例，排除合并其他病毒感染者。肝穿活組織經10%甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋，連續切片。以肝移植健康供肝肝組織標本作為對照組（n=10）。

二、主要試劑 鼠抗人α-SMA、鼠抗人COX1、鼠抗人COX2和EliVisionTM System檢測試劑盒為Dako公司產品，DAB顯色劑購自北京中杉生物技術有限公司；兔抗人血管緊張素II（AngII）I型受體購自武漢博士德生物工程有限公司。

三、免疫組織化學檢測 主要步驟如下：石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2-蒸餾水37℃孵箱去除內源酶;以抗原熱修復法進行抗原熱修復，微波爐煮沸持續15min；室溫自然冷卻;PBS沖洗5min×3次，分別滴加兔抗人AT1單克隆抗體（稀釋濃度1：100）、鼠抗人α-SMA單克隆抗體（稀釋濃度1：150）、鼠抗人COX1單克隆抗體（稀釋濃度1：150）、鼠抗人COX2單克隆抗體（稀釋濃度 1：100），4℃冰箱過夜；PBS 沖洗 5min×3次；滴加適當比例稀釋的辣根酶標記二抗，室溫40min；PBS沖洗 5min×3次；DAB 顯色；蘇木素襯染細胞核、封片。陽性染色呈棕黃色。磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察陽性細胞在CHB患者肝組織內的分布，每張切片選取5個以上典型匯管區和肝小葉，于200倍視野下計數陽性細胞數。

四、病理形態學觀察 常規HE染色觀察肝組織形態學變化。

五、統計學分析 采用SAS 8.0統計學軟件，進行單向有序的R×C表的logistic回歸分析。

結 果

一、肝組織α-SMA的表達 肝小葉內竇周纖維化區域、纖維增生明顯，匯管區內及其小血管周圍、血竇壁及邊緣區可見α-SMA陽性細胞浸潤。在S4期肝組織內，小葉結構紊亂，纖維間隔內及周圍竇壁細胞內有強陽性表達（圖1）。

圖1 S4期肝組織α-SMA的表達 小血管周圍呈強陽性（EliVisionTM System 法，×200）

二、肝組織COX1的表達 COX1蛋白表達于細胞漿，在S3期肝組織，小葉結構紊亂，殘留的匯管區、肝細胞及竇壁細胞COX1呈高表達，纖維間隔周圍部分少數炎細胞也有表達（圖2）。

圖2 S3期肝組織COX1的表達 肝細胞漿呈高表達（EliVisionTM System 法，×100）

三、肝組織COX2的表達 COX2蛋白表達于細胞漿，在S2期肝組織內殘留的匯管區及纖維間隔周邊部的間質細胞、炎細胞內COX2呈高表達，周圍肝細胞、竇壁細胞呈弱表達（圖3）。

圖3 S2期肝組織COX2的表達 在間質細胞和炎細胞內COX2呈高表達（EliVisionTM System 法，×200）

四、肝組織AngII的表達血管緊張素II（AngII）在纖維間隔內及部分間質細胞呈強陽性表達，在硬化結節的竇壁細胞及部分肝細胞內表達上調。小血管壁內皮及平滑肌細胞也呈陽性表達（圖4）。

圖4 活動期肝硬化肝組織AngII的表達 在纖維間隔內及部分間質細胞呈強陽性表達（EliVisionTM System法，×100）

五、肝組織AT1的表達 在肝硬化肝組織纖維間隔周邊部肝細胞及間質細胞，AT1呈強陽性表達（圖 5）。

圖5 肝硬化肝組織AT1的表達 染色陽性產物定位于肝細胞質（EliVisionTM System 法，×100）

討 論

肝竇內皮細胞（SEC）含有收縮調節蛋白（α-肌動蛋白），肝竇直徑的生理調節由肝星狀細胞（HSC）控制。在竇狀隙周圍激活的肝星狀細胞表達α-SMA，并導致竇狀隙周圍肝纖維化的發展。肝損傷后肝星狀細胞激活的最突出特征是調節竇周血管收縮力顯著增強，致使肝臟血管排列紊亂，使門脈高壓的肝臟內阻力增加[1～3]。

本研究顯示，在肝纖維化的肝組織中α-SMA呈強陽性，α-SMA陽性平滑肌細胞、肌纖維母細胞散在分布于小血管周圍、邊緣區，較健康對照肝組織數目有所增加。

COX有兩種同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1為結構型表達，COX-2為誘生型表達。本研究結果顯示，肝細胞及竇壁細胞COX-1呈高表達。文獻報道，COX-2是惡性轉化的早期標志[5]。最近報道，COX-2在HCC病人中有過表達，選擇性COX-2抑制物有利于惡性腫瘤的治療[6]。對門脈高壓小鼠小劑量阿司匹林有抑制血小板活性作用，是通過COX2途徑而不是COX1途徑[7]。在脂肪肝、炎癥和壞死病理改變的肝組織中，促炎性調解蛋白COX-2mRNA表達水平顯著增加，與壞死性炎的改變相一致[4]。COX-2是肝臟炎癥和纖維化形成的關鍵作用因子[8，9]。

人和大鼠HSC均表達AT1，并且外源性AngII能刺激其收縮和增殖[10]。肝臟局部存在由HSC合成和分泌的RAAS，它作用于自身AT1R受體，促進HSC增殖和分泌細胞外基質，促進肝纖維化發生。本研究結果顯示，慢性乙型肝炎和肝硬化活檢肝組織內α-SMA、COX2、AngII及 AT1 表達水平明顯上調。α-SMA、COX2、AngII、AT1 在慢性乙型肝炎及肝硬化肝臟微循環障礙的發生發展中起一定的作用。

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