內皮素-1和血管內皮生長因子及缺氧誘導因子-1在門脈高壓性胃病中的作用

李樹娟 邵石祥 耿國鈺 蔡莉芬 盧建華 何朝霞 葉立紅

門脈高壓性胃病(portal hypertensive gastropath，PHG)是肝硬化或肝外型門靜脈高壓癥(PHT)的一種并發癥，臨床上多表現為慢性隱匿性出血，是肝硬化患者上消化道出血的重要原因。本文采用免疫組織化學(免疫組化)技術檢測內皮素-1(ET-1)、血管內皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導因子-1(HIF-1)在在PHG患中胃黏膜表達情況，觀察PHG胃黏膜的組織學表現，測定PHG患者的門靜脈、脾靜脈血流量，旨在探索PHG發病機制，對PHG的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取我院2006年10月至2008年12月PHT患者共60例，其中男41例，女19例;年齡22～67歲，平均年齡51．55歲;乙型、丙型肝炎肝硬化56例，酒精性肝硬化2例，原發性膽汁性肝硬化1例，隱原性肝硬化1例;肝功能按Childpugh分級，A級27例，B級32例，C級1例。PHT無PHG組:30例符合肝硬化PHT診斷標準，胃鏡下無PHG;PHG組:30例符合肝硬化PHT和PHG診斷標準。正常對照組30例，男25例，女5例;年齡19～62歲，平均年齡40．85歲;對照組采用胃鏡下黏膜大致正常無肝病并符合排除標準者。所有受試者于胃鏡及B超檢查前1周停用降門脈壓藥物、NASID類、生長抑素類藥以及影響血管活性的藥物。

1．2 納入與排除標準 (1)納入標準:肝硬化根據2000年9月中華醫學會傳染病與寄生蟲病學會分會、肝病學分會聯合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中肝硬化的診斷標準。PHG內鏡診斷參考1992年新意大利內鏡協會(new Italy endoscopy club，NIEC)分類法。(2)排除標準:除外高血壓動脈粥樣硬化、腦梗死、腦血栓、支氣管哮喘和腎衰竭等疾病，并除外曾行胃大部切除術、脾切除術、斷流術、分流術、近期大出血者及食管靜脈曲張硬化術和結扎術者。

1．3 方法

1．3．1 病理標本的采集:行胃鏡檢查時取胃竇黏膜組織2塊，取距幽門5 cm內的胃大彎和胃小彎胃體2塊，取于胃體上部大彎和小彎共活檢2塊。標本要足夠大，達到黏膜肌層。中性甲醛溶液固定，常規石蠟切片，4%戊二醛固定，送石家莊市第五醫院病理室。

1．3．2 門靜脈血流量(portal venous flow，PVF)、脾靜脈血流量(spleen venous flow，SVF)測定:患者空腹8～12 h靜息狀態下、取仰臥位，于上午探查門靜脈、脾靜脈。探頭頻率3．5～4．0 MHz，取樣容積2～6 mm，取樣線與血流夾角 ＜60°。檢查時患者暫時平靜呼吸后屏氣，取3次結果的平均值，同一患者每次測定門靜脈系統時，取樣位置固定，取樣線和血流夾角保持一致。由同一名經驗豐富的超聲科醫師操作。分別檢測門靜脈內徑(Dpv)和血流速度(Vpv)脾靜脈內徑(Dsv)和血流速度(Vsv)。計算靜脈血流量(Q)，計算公式Q=(D/2)2Vπ×60(Q為血流量;D為靜脈直徑;V血流速度)。

1．3．3 試劑:人抗多克隆抗體(武漢博士德生物技術公司)，SP試劑盒(北京中山生物技術公司)，氨丙基三乙氧基硅烷(APES)(北京中山生物技術公司)。

1．3．4 HE染色:①胃組織做4μm連續切片，經漂片后貼附于經充分沖洗經APES處理過的載玻片上。撈片后置烤箱60℃，45 min，使切片緊密薪附、染色。②ET-1、VEGF、HIF-1免疫組織化學染色:石蠟包埋的胃組織以4μm的厚度連續切片，按試劑盒步驟進行3種因子的免疫組織化學染色。③免疫組織化學染色對照設置:以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗進行上述染色，作為空白對照，結果為陰性。棕褐色為陽性染色。

1．3．5 免疫組化結果判斷標準:染色后光鏡下做定性觀察。取200倍高倍視野下VEGF顯色最強的一個視野，通過顯微攝影系統攝取圖像，在圖像分析儀上應用免疫組化計算面積軟件做定量分析代表陽性面積率。

1．3．6 PHG積分判定標準:PHG程度按改良的McMrmark’s分級分為:無，得0分;輕度為蛇皮征和(或)淡紅色斑點，得1分;重度為櫻桃紅斑得2分;出血得3分。PHG積分判定由3位有經驗的胃鏡室醫師盲法評估。

1．3．7 食道靜脈曲張判定標準:按2000年3月昆明的《食管靜脈曲張內鏡下診斷和治療規范試行方案》，將食道靜脈曲張分為輕、中、重度。

1．4 統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以ˉx±s表示，各組間分析用單因素隨機區組方差分析(one-way ANOVA)，計數資料相關性檢驗采用成組設計多個樣本比較的秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 PHG患者的內鏡下表現 內鏡下可見PHG特征性的表現馬賽克征、紅點征、櫻桃紅斑。食管靜脈曲張內鏡下可見食管呈蛇行迂曲或串珠狀結節狀，有的可見紅色征。

2．2 PHG患者胃黏膜病理表現 光鏡觀察黏膜毛細血管彌漫性擴張，大多有紅細胞滲出，黏膜固有層充血水腫，炎癥不明顯。

2．3 PHG積分與食管靜脈曲張程度的相關性分析 PHG積分與食管靜脈曲張程度無相關性(HC=4．782，P ＞0．05)。

2．4 PVF、SVF測定值 PHG組PVF顯高于正常對照組(P＜0．05)。PHT無PHG組PVF與PHG組相比差異無統計學意義(P＞0．05)。PHG組患者SVF顯著性高于正常對照組(P＜0．05)。PHT無PHG組SVF與PHG組比較差異無統計學意義(P ＞0．05)。見表1。

表1 3組PVF和SVF比較n=30，m l/min，±s

表1 3組PVF和SVF比較n=30，m l/min，±s

注:與正常對照組比較，*P ＜0．05

PVF SVF正常對照組組別674±234 221±79 PHT無PHG組 954±394* 502±486*PHG組 988±293* 533±327*

2．5 胃黏膜組織 ET-1、VEGF、HIF-1表達 PHG組胃黏膜中ET-1、VEGF、HIF-1的陽性面積顯著性高于正常對照組(P＜0．05)，PHT 無PHG 組ET-1、VEGF、HIF-1 陽性面積表達與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0．05)。EF1主要表達于胃黏膜上皮細胞，胃黏膜肌層附近的血管內皮細胞，平滑肌細胞等組織細胞的胞漿中。主要表達于胃小凹頸部黏膜細漿內，其他部位有少量陽性著色。正常對照組胃黏膜僅見少量陽性表達。PHT無PHG組陽性面積表達與正常對照組比較差異無統計學意義(P＞0．05)。主要分布于胃黏膜病變部位腺體細胞的細胞漿和細胞核，血管內皮細胞也有分布。PHT無PHG組陽性面積表達與正常對照組比較差異無統計學意義。見表2。

2．6 胃黏膜組織ET-1、VEGF、HIF-1表達與PHG患者內鏡下積分的相關性分析 ET-1、VEGF、HIF-1與PHG積分呈正相關(H 分別為 10．592、10．614、9．852，P ＜0．05)。見表 2。

表2 3組ET-1、VEGF、HIF-1陽性面積表達比較n=30，%，±s

表2 3組ET-1、VEGF、HIF-1陽性面積表達比較n=30，%，±s

注:與正常對照組比較，*P ＜0．05

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2．7 HIF-1和VEGF之間的關系 HIF-1陽性表達和VEGF的陽性表達之呈直線相關(Pearson相關系數為0．842，P ＜0．01)。

3 討論

PHG是肝硬化患者上消化道出血的重要原因。內鏡下主表現:有猩紅熱樣黏膜表面發紅、櫻桃紅斑、紅色斑、瘀點、糜爛和自發性出血等。PHG出血可以表現為慢性隱匿性出血和貧血，也可以表現為致命的上消化道大出血。

3．1 PHG患者胃黏膜組織學特點 本研究發現PHG患者胃黏膜層毛細血管彌漫性擴張，并可見紅細胞滲出毛細血管外，黏膜固有層充血水腫。提示在肝硬化PHT患者中胃黏膜毛細血管內，血流受PHT的影響，血漿從增多、增寬的窗孔及缺損處漏出，導致胃黏膜充血、水腫、缺氧，繼而引起黏膜上皮損傷或在此基礎上并發炎性細胞浸潤。

3．2 PHG與食管靜脈曲張的關系 本研究中有52．38%的PHT患者并發PHG，但經統計學分析并未發現PHG積分與食管靜脈曲張有關。目前研究均認為PHT是PHG的啟動因素和必要條件。PHT時門靜脈壓力高于胃靜脈，致胃靜脈血液回流受阻，胃黏膜及黏膜下毛細血管擴張，動靜脈短路形成與開放，胃黏膜有效循環血流量減少［1］。本研究結果顯示，PHG組與PHT無PHG組PVF和SVF明顯高于正常對照組(P＜0．05)。說明PHT患者存在高動力循環狀態。

3．3 ET-1在胃黏膜中的表達及意義 ET-1具有收縮血管作用，作用主要是通過其特異性受體介導，尤其在調節血管張力和局部組織微循環中起著非常關鍵的作用。近來發現特異的內皮素受體至少有兩種:ETAR和ETBR。ET-1也可通過激活ETAR而增強胃微血管的通透性。PHG動物實驗表明，ETAR/ETBR的拮抗劑可逆轉PHG胃黏膜的高通透性。研究發現，PHG組患者胃黏膜中ET-1的陽性面積顯著性高于正常對照組，主要表達于胃黏膜上皮細胞，胃黏膜肌層附近的血管內皮細胞，平滑肌細胞等組織細胞的胞漿中。ET-1與PHG積分呈顯著性正相關。因此，在PHG的ET-1過量產生可通過ETAR而損害胃黏膜微循環。

3．4 VEGF在胃黏膜中的表達及意義 VEGF是一種特異地作用于血管內皮細胞的多功能因子，具有促進微靜脈、小靜脈通透性增加，血管內皮細胞分裂、增殖、細胞質鈣聚集以及誘導血管生成等作用。本研究顯示，PHG組患者胃黏膜中VEGF的陽性表達顯著性高于正常對照組。主要表達于胃小凹頸部黏膜細漿內，其他部位有少量陽性著色。趙永忠等［2］發現門靜脈高壓癥大鼠模型胃黏膜中VEGF表達明顯升高，同時胃黏膜血管VEGF高表達說明VEGF還可以增加血管通透性，增加胃黏膜出血幾率。Brat等［3］發現PHT大鼠模型胃黏膜血流量降低，VEGF表達高于對照組，臨床和動物實驗均證實了胃黏膜VEGF的高表達在PHG發病機制中的重要意義。

3．5 HIF-1在胃黏膜中的表達及意義 胃黏膜血液循環障礙是PHT的重要病理生理變化和PHG的主要發生機制［4］。胃黏膜微循環瘀血，大量動靜脈短路開放，使胃黏膜組織細胞得不到充分的氧和營養供應，胃黏膜處于缺氧狀態。Brat等［3］發現PHT大鼠模型胃黏膜血流量降低，低氧狀態誘導一系列特異性的與血管生成、缺氧代謝密切相關的基因，其中起關鍵作用的是HIF-1。這些靶基因的啟動子或增強子有一個小于100 bp的DNA序列，稱為缺氧反應元件(HRE)［5］，介導細胞對缺氧的反應。其中具有一個或多個HIF-1結合位點(共有序列，5'A/GGGTG3')，該位點的突變將導致缺氧誘導轉錄反應的喪失?；罨腍IF-1與靶基因上的HIF-1結合位點相結合，形成轉錄起始復合物從而啟動靶基因的轉錄［6］。實驗結果顯示，PHG組患者胃黏膜中HIF-1的陽性表達顯著性高于正常對照組。主要分布于胃黏膜病變部位腺體細胞的細胞漿和細胞核，血管內皮細胞也有分布。參與了PHG的發生和發展，通過促進新生血管形成，加重PHG。

3．6 HIF-l和VEGF表達的關系HFI-1是由一個120 kD的α亞單位和一個91/93/94 kD的β亞單位組成的異源二聚體轉錄因子。HIF-1α是惟一的氧調節亞單位，決定HIF-1的活性，在低氧條件下能誘導VEGF以及一些下游基因的表達，最終導致缺血組織的新生血管形成［7］。

本研究顯示，HIF-1與VEGF表達在PHG組呈正相關，表明HIF-1通過調節VEGF表達升高，擴張血管促進高動力循環，增加管壁通透性，加重瘀血水腫，進一步削弱胃黏膜屏障，形成惡性循環，從而使PHG加重。但從相關系數看，相關程度并不十分密切，說明了缺氧狀態除了通過HIF-1外，還有其他途徑影響著VEGF的表達或還有其他因素通過影響VEGF的表達在PHG的發生發展過程中發揮著重要作用。

綜上所述，ET-1、VEGF、HIF-I在 PHG的發生、發展過程發揮著重要作用，為PHG的防治提供了重要的理論依據。

1 黃自平，梁擴寰．門脈高壓癥患者的胃黏膜病變．中華消化雜志，1988，27:210-213．

2 趙永忠，王波，王天才，等．血管內皮生長因子在大鼠門脈高壓性胃病發病機制中的作用．華中科技大學學報(醫學版)，2003，32:163-165．

3 Brat DJ，Kuar B，Van Meir EG．Genetic modulation of hypoxia induced gene expression and angiogenesis:relevance to brain tumors．Front Biosei，2003，8:d100-106．

4 ejudo-Martin P，Morales-Ruiz M，Ros J，et al．Hypoxia is an inducer of vasodilator agents in peritoneal mucrophages of cirrhotic patients．He Patology，2002，36:1172-1179．

5 Tipoe GL．Fung ML．Expression of HIF-1 lalpha，VEGF and VEGF receptors in the carotid body of chronically hypoxia rat．Respir Physiol Neurobio，2003，138:143-154．

6 Pufe T，Lemke A，Kurz B，et al．Mechanical overload induces VEGF in cartilage discs va hypoxia-inducible factor．Am JPathol，2004，164:185-192．

7 Buchler P，Reber HA，Buchler Mw，et al．Antiangiogenic activity of genistein in Pancreatic carcinoma cells is mediated by the inhibition of hypoxia-inducible factor-1 and the down regulation of VEGF gene expression．Cancer，2004，100:201-210．