頸椎旁肌和韌帶異常對頸椎退行性變影響的實(shí)驗(yàn)研究

孫先澤 申勇 李鋒 任亮 顧振芳

頸椎病的起始病因是頸椎間盤退變，在退變的不同時(shí)期可出現(xiàn)一些不同病理改變。頸椎不穩(wěn)是其早期的一個(gè)表現(xiàn)［1］。一些因素影響著頸椎間盤的退變和頸椎不穩(wěn)的發(fā)生，但具體機(jī)制仍不是很清楚。我們擬在動(dòng)物模型上重現(xiàn)頸椎退變的過程，從而對頸椎病的發(fā)病機(jī)制有更深入的了解。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)選用新西蘭大白兔36只，雌雄不限，6～9個(gè)月齡，體重 2．5～3．0 kg，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(醫(yī)動(dòng)字第DK0507-0102)。將36只動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組2組，實(shí)驗(yàn)組20只，對照組16只，每組再分為4個(gè)月(10～13個(gè)月齡)和10個(gè)月(16～19個(gè)月齡)2個(gè)亞組，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)亞組10只，對照組每個(gè)亞組8只。

1．2 實(shí)驗(yàn)儀器 Leica-Rm2152石蠟切片機(jī)和Olympus BH-2生物顯微鏡。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:術(shù)前1 d禁食水，枕后及頸背部備皮。

1．3．2 手術(shù)方法:參照文獻(xiàn)報(bào)道方法造模［2］。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頸后部剪毛及清潔后，用氯氨酮0．1 g/kg肌內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后將動(dòng)物俯臥于手術(shù)臺(tái)上，消毒鋪巾，從環(huán)枕關(guān)節(jié)至第二胸椎棘突切開長約7 cm皮膚后，暴露棘突，將附著于棘突、椎板及小關(guān)節(jié)的肌肉全部分離開，然后切斷C1棘上和棘間韌帶，縫合皮膚。對照組動(dòng)物同樣切開皮膚，但不作肌肉分離和韌帶切除。

1．3．3 術(shù)后處理:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同房間單籠喂養(yǎng)，光照時(shí)間及飲食、飲水時(shí)間相同，所用飼料由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)配置，術(shù)后讓動(dòng)物在籠中自由活動(dòng)，切口以無菌敷料包扎，每日肌內(nèi)注射青霉素40萬U，共3 d，傷口均甲級愈合，縫線于2周時(shí)自行脫落。

1．3．4 術(shù)后檢查及取材:觀察組在術(shù)后4個(gè)月分別作頸椎正側(cè)位、過伸過屈側(cè)位X線攝片，檢查完畢后將動(dòng)物處死，完整取下包含上下終板的C4，5和C5，6椎間盤，標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定。10個(gè)月觀察組檢查方法及取材方法同上。

1．3．5 切片的制備:經(jīng)甲醛固定24 h后，切除一側(cè)軟骨終板，然后置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)溶液中，每隔2 h換液浸泡，直至另一側(cè)軟骨終板能被針頭刺入，脫鈣成功;將脫鈣后的椎間盤浸泡Bouin氏液固定;采用80%、90%、95%、100%乙醇各1 h行梯度乙醇脫水;二甲苯透明2 h;浸蠟2 h;石蠟包埋并修整蠟塊后，沿所取椎間盤的矢狀切面制作石蠟切片，厚度為5～6μm，將切片分別裱于涂有蛋白甘油的載玻片上，置37℃溫箱內(nèi)干燥24 h;常規(guī)方法鐵蘇木素及伊紅行HE染色，中性樹膠封片。

1．4 觀察指標(biāo)

1．4．1 X 線片分析:根據(jù) Guigui等［3］介紹的方法進(jìn)行劃線測量水平移位，角位移為經(jīng)過相鄰兩椎體下緣直線間的夾角。根據(jù)White等［4］在生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)相鄰椎體移位超過椎體矢狀徑的20%作為診斷前后不穩(wěn)的標(biāo)準(zhǔn)，相鄰椎體之間的角位移超過11°時(shí)診斷為成角不穩(wěn)。采用誤差為0．02mm的油標(biāo)卡尺及多用角尺測量椎體的水平位移和角位移。

1．4．2 椎間盤退變程度分級:在Olympus BH-2生物顯微鏡下觀察每個(gè)椎間盤矢狀切面情況并進(jìn)行分級。Miyamoto法對頸椎間盤退變程度作分級評定［5］:Ⅰ級:正常椎間盤結(jié)構(gòu)，外周由規(guī)則排列的纖維環(huán)和中央大的髓核組成;Ⅱ級:軟骨增生，纖維環(huán)前部板層狀結(jié)構(gòu)的破壞;Ⅲ級:髓核縮小或消失;Ⅳ級:纖維環(huán)破裂或出現(xiàn)裂隙;Ⅴ級:髓核突出或有骨化形成。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用四格表確切概率法，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 影像學(xué)檢查結(jié)果 對照組4個(gè)月未見椎間隙狹窄、骨贅形成和序列異常。實(shí)驗(yàn)組4個(gè)月無骨贅形成，但有不穩(wěn)定存在。對照組10個(gè)月與實(shí)驗(yàn)組4個(gè)月基本相同。實(shí)驗(yàn)組10個(gè)月可見椎間隙狹窄、骨贅形成，多見于 C4，5、C5，6、C6，7，且有不穩(wěn)定存在，不穩(wěn)定均存在于 C4，5和 C5，6，出現(xiàn)不穩(wěn)定的節(jié)段數(shù)。4個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與對照組相比出現(xiàn)不穩(wěn)的節(jié)段數(shù)的陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，10個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與對照組相比出現(xiàn)不穩(wěn)的節(jié)段數(shù)的陽性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見表1。

表1 2組頸椎不穩(wěn)定陽性率比較 個(gè)(%)

2．2 頸椎間盤退變的組織學(xué)表現(xiàn) 4個(gè)月對照組動(dòng)物的組織學(xué)無明顯變化，椎間盤的中央是大的髓核，周圍是規(guī)則的纖維環(huán)，終板包括一層薄的透明軟骨。10個(gè)月對照組可見椎間盤退變，包括髓核的縮小和纖維環(huán)板層結(jié)構(gòu)的紊亂。4個(gè)月實(shí)驗(yàn)組椎間盤的退變較明顯，主要包括髓核的縮小或消失和纖維環(huán)出現(xiàn)裂隙，部分椎間盤可以突出。10個(gè)月實(shí)驗(yàn)組椎間盤退變更加明顯，以椎間盤突出和骨贅形成為特點(diǎn)。對照組10個(gè)月Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級退變率與4個(gè)月比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。4個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級退變率與對照組相比退變明顯(P ＜0．05)，10個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級退變率與對照組相比退變更加明顯(P＜0．05)。見表2。

表2 2組兔頸椎間盤光鏡下退變程度分級情況比較個(gè)(%)

3 討論

頸椎的活動(dòng)節(jié)段是頸段脊柱的基本功能單位，它由上下相鄰的兩節(jié)頸椎及其附著的軟組織組成，是頸椎最小的功能單位。正常人體頸椎穩(wěn)定性由兩大部分來維持［6］:一是內(nèi)源性穩(wěn)定，包括椎體、附件、椎間盤和相連的韌帶結(jié)構(gòu)，為靜力性平衡，二是外源性穩(wěn)定，主要為頸部肌肉的調(diào)節(jié)與控制，它是脊柱運(yùn)動(dòng)的原始動(dòng)力，為動(dòng)力性平衡。本實(shí)驗(yàn)通過剝離椎旁肌，切除棘上、棘間韌帶，使正常的內(nèi)外源穩(wěn)定系統(tǒng)均遭到破壞，引起兔的下頸椎退變來模擬人的下頸椎退變，對下頸椎退變的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，通過4～10個(gè)月的觀察，出現(xiàn)了頸椎退行性不穩(wěn)的表現(xiàn)，4個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與對照組相比出現(xiàn)不穩(wěn)的節(jié)段數(shù)的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，說明即使存在力學(xué)的不穩(wěn)，4個(gè)月也不足以引起明顯的頸椎的節(jié)段不穩(wěn)。10個(gè)月實(shí)驗(yàn)組與10個(gè)月對照組相比出現(xiàn)不穩(wěn)的節(jié)段數(shù)的陽性率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，說明10個(gè)月出現(xiàn)了明顯的頸椎不穩(wěn)，力學(xué)的不穩(wěn)加速了頸椎退行性不穩(wěn)的出現(xiàn)，進(jìn)一步說明肌肉和韌帶對維持頸椎穩(wěn)定性的重要性。

椎間盤由4層同心圓形排列的組織組成，由外向內(nèi)依次是:(1)外層纖維環(huán):是一層環(huán)形的高密度包裹膠原纖維，主要由成纖維樣細(xì)胞、纖維細(xì)胞組成。(2)內(nèi)層纖維環(huán)——纖維軟骨層。(3)過渡區(qū):介于纖維環(huán)和髓核間，內(nèi)層纖維環(huán)和過渡區(qū)細(xì)胞酷似軟骨細(xì)胞。(4)中央的髓核，髓核中包含原始的脊索細(xì)胞，到成年后脊索細(xì)胞逐漸消失，只剩余軟骨樣細(xì)胞［7－9］。椎間盤體積和形狀隨成長而變化，待骨骼成熟以后又發(fā)生相反的變化，而且人與人之間，同一人的不同椎間盤之間生長和退變的速度和程度也不一樣，但過程是相似的，而且在很大程度上退變發(fā)生在髓核。髓核中的細(xì)胞數(shù)、蛋白多糖及水均減少，同時(shí)出現(xiàn)蛋白多糖碎片的聚集［7－10］。總之，椎間盤的完整性有所減弱，椎間盤的容量和形態(tài)開始變化，椎間盤突出的可能性增大，隨著年齡的增大，外層纖維環(huán)內(nèi)的組織變成硬的軟骨盤，椎間盤的高度降低，中心部位碎裂的椎間盤及裂隙更加明顯，髓核變得更小，周圍膠原纖維的密度及排列方式發(fā)生改變，幾乎沒有什么細(xì)胞存在，椎間盤高度和組成成份的改變影響了脊柱的穩(wěn)定性，改變了脊柱的力線，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、韌帶及椎旁肌承擔(dān)了更多的載荷，所有這些變化與脊柱的穩(wěn)定性、椎管狹窄和關(guān)節(jié)突的退變有一定關(guān)系。由于頸椎骨的剛度明顯大于椎間盤的剛度，在載荷的作用下，因椎間盤變形使頸椎發(fā)生位移和旋轉(zhuǎn)，因此頸椎不穩(wěn)和椎間盤退變互相影響，互為因果。本實(shí)驗(yàn)通過剝離兔頸椎旁肌和切除棘上棘間韌帶來改變頸椎的力學(xué)性能，通過4～10個(gè)月的觀察，并進(jìn)行光鏡檢查，對照組10個(gè)月與4個(gè)月比較發(fā)現(xiàn)隨著增齡頸椎間盤的退變明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。4個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比退變明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，10個(gè)月時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對照組相比退變更加明顯(P＜0．05)。從以上發(fā)現(xiàn)可以得出頸椎肌肉和韌帶的異常所導(dǎo)致的力學(xué)的不穩(wěn)誘發(fā)和加速了頸椎間盤的退變。

本項(xiàng)研究的局限性在于不能對頸椎不穩(wěn)所引起的臨床癥狀進(jìn)行研究，只能得出頸椎椎旁肌及韌帶的異常可以加速頸椎間盤退變和頸椎不穩(wěn)過程。提示我們要重視肌肉和韌帶異常對頸椎穩(wěn)定性的影響。

1 Dai L．Disc degerative and cervical instability．Correlation of magnetic resonance imaging with radiography．Spine，1998，23:1734-1738．

2 彭寶淦，施杞，沈培芝，等．一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)性頸椎病動(dòng)物模型．中國中醫(yī)骨傷科雜志，1996，4:10-15．

3 Guigui P，Benoist M，Deberge A．Spinal deformitry and instability after multilevel cervical laminectomy for spondilotic myelopathy．Spine，1998，23:440-447．

4 White AA，Southwick WO，Panjabi MM．Clinical instability in the lower cervical spine:a review of past and current concepts．Spine，1976，1:15-27．

5 Thompson JP，Pearce RH，Schechter MT，et al．Preliminary evaluation of a scheme for grading the grossmorphology of the human intervertebral disc．Spine，1990，15:411-5．

6 王以進(jìn)，王介麟文編．骨科生物力學(xué)．第1版．北京:人民軍醫(yī)出版社，1989．156-191．

7 Buckwalter JA．Fine structural studies of human intervertebral disc．In:White AA，Gordon SL，eds．Idiopathic Low Back Pain．St．Louis:CV Mosby，1982．108-143．

8 Trout JJ，Buckwalter JA，Moore KC．Ultrastructure of human intervertbral disc Ⅱ．Cells of the nucleus pulposus．Anat Rec，1982，204:307-14．

9 Trout JJ，Buckwalter JA，Moore KC，et al．Ultrastructure of human intervertbral disc Ⅱ．Cells of the nucleus pulposus．Anat Rec，1982，204:307-314．

10 Buckwalter JA，Roughley PJ，Rosenberg LC．Agerelated changes in cartilage proteoglycans:Quantitative electron microscopic studies．Microscopy Research and Techniques，1994，28:398-408．