Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期糖尿病腎病患者血清糖基化終末產物水平影響因素分析

張國欣 徐金升 阮琳 薛蘭芬 聶麗敏 潘志蘭 牛文明

糖基化終末產物(AGEs)是還原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)與蛋白質、氨基酸等的游離氨基酸通過一系列復雜的非酶促反應形成的結構多樣的不可逆聚合物［1］。在不同組織中AGEs的聚集可以通過誘發氧化應激等機制導致糖尿病的各種慢性并發癥［2］。腎臟是氧化應激反應比較敏感的組織，所以AGEs在糖尿病腎病的發生發展中起著重要作用。本試驗探討了糖化血紅蛋白(HbA1c)、血肌酐水平及糖尿病腎病分期對血清AGEs水平的影響，以期為進一步研究AGEs在糖尿病腎病中的作用提供依據。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2007年1至9月在我科住院明確診斷糖尿病腎病患者27例，男15例，女12例;平均年齡(64±7)歲;所有患者糖尿病病史＞5年，查眼底均合并視網膜病變，既往無高血壓及腎臟病史。按Mogensen的DN分期:Ⅲ期DN患者(尿微量白蛋白30～300 mg/24 h)8例，Ⅳ期DN患者 (尿蛋白定量＞0．5 g/24 h)11例，Ⅴ期未進行血液透析DN患者血肌酐(Scr)＞133 μmol/L［(239±98)μmol/L］8例。

1．2 方法 血清AGEs的檢測采用競爭性 ELISA法，由于AGEs存在共同的抗原決定簇，因此，可以用單一AGEs修飾蛋白的抗體檢測總AGEs。在多種AGEs修飾蛋白中抗AGERNase抗體能夠非選擇性地識別所有 AGEs復合物，但與非AGEs修飾的蛋白及Amadori物質不起反應。

1．2．1 標準曲線及標準方程的建立［3］:3 mg/L AGE-Ag 100μl包被96孔板(pH 9．6碳酸氫鹽緩沖液)，37℃ 2 h，4℃過夜，封閉1 h(封閉液0．01 mmol/L，PBS-1%BSA，150 μl)，洗3次;加入不同濃度標準 AGE-Ag(分 別 為 100、10、8、4、2、1、0．1 mg/L)和 AGE-Ab各50 μl(1∶1 000)，同時設總對照(不加標準AGE-Ag)和空白對照(不加AGE-Ab)，室溫孵育2 h，振蕩，洗3 次;加AKP-羊抗兔 IgG(1∶4 000，Sigma)100 μl，37℃孵育1 h，洗6次，稀釋液均為0．01mmol/L PBS和0．5%Tween 20和2%山羊血清混合液，清洗液均為0．01 mmol/L PBS和0．5%Tween 20的混合液，均設復孔。最后pNPP底物(Sigma)顯色，在405 nm波長下讀取A值，至總對照A值在1．2～1．5，計算標準 AGE-Ag A比值 =(標準 A 405-空白 A 405)/(總A405-空白A 405)。各標準濃度AGE-Ag A比值與其濃度之間關系模擬方程 y=1/(1+a×b)，擬合得方程 y=1/(1+0．1170 ×0．7081)。經統計學檢驗 R=0．9915，R2=0．9830，P ＜0．01。表明通過此方程，標準 A 405值能反映其AGEs水平。

1．2．2 血清AGEs檢測:－80℃冰箱保存的DN患者血清標本經1∶5稀釋后進行AGEs檢測，均設復孔，取其平均A值代入上述方程計算出各標本AGEs水平。

1．3 統計學分析 應用SPSS 10．0統計軟件，糖尿病腎病患者AGEs水平采用方差分析，糖尿病腎病患者血清AGEs水平與年齡、性別、HbA1c水平及糖尿病腎病分期之間關系采用多元逐步回歸分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期組血清AGEs水平兩兩比較差異有統計學意義(P ＜ 0．05)。見表1。

2．2 2 型糖尿病腎病患者中血肌酐水平正常組與升高組血清AGEs水平分別為(32±7)μg/ml和(43±10)μg/m l，后者較前者顯著增高(P＜0．01)。

2．3 對27例2型糖尿病腎病患者進行多元逐步回歸分析顯示在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期糖尿病腎病患者中血清AGEs水平與分期及HbA1c有關(標準回歸系數均為0．548、0．327，P ＜0．05)。

3 討論

AGEs是還原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)與蛋白質、氨基酸等的游離氨基酸通過一系列復雜的非酶促反應形成的結構多樣的不可逆聚合物。目前有證據表明AGEs在糖尿病慢性并發癥包括大血管病變、微血管病變(糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、糖尿病心肌病等)、神經病變等的發生發展中起著重要作用。檢測體內AGEs對臨床進一步研究糖尿病慢性并發癥的發生、評估并發癥的程度、監測長期血糖水平以及指導糖尿病治療等將具有十分重要的意義［4］。AGEs檢測方法包括熒光分析法、放射受體分析法、免疫學方法、高效液相層系(HPLC)等。ELISA法因其操作簡便、靈敏度和特異性也很高，有望在臨床大規模開展。

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平相關影響因素多元逐步回歸分析 μg/m l，±s

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平相關影響因素多元逐步回歸分析 μg/m l，±s

注:與Ⅲ期比較，*P ＜0．05;與Ⅳ期比較，#P ＜0．05

變量 AGEs P值年齡(歲)＜65(n=9) 33±6 ＞0．05≥65(n=18) 37±11性別男(n=15) 37±10 ＜0．05女(n=12) 34±9血肌酐水平正常組(n=19) 32±7 ＜0．01增高組(n=8) 43±10 HbA1c(%)＜8(n=10) 30±6 ＜0．01≥8(n=17) 39±10糖尿病腎病分期Ⅲ(n=8) 28±6Ⅳ(n=11) 36±6* ＜0．05Ⅴ(n=8) 43±10*#

糖尿病腎病是糖尿病的一種最常見的慢性微血管并發癥，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN分為5期。Ⅲ期亦稱早期糖尿病腎病，多發生在病程＞5年的糖病腎患者。主要表現為尿蛋白排泄率持續于20～200μg/min(30～300 mg/24 h)，尿常規蛋白定量＜0．5 g/24 h，基底膜增厚和系膜基質明顯增加;Ⅳ期即臨床糖尿病腎病，以大量白蛋白尿為特點，糖尿白排泄率＞200μg/min(＞300 mg/24 h)，或常規尿蛋白定量＞0．5 g/24 h，腎小球濾過率下降，并出現高血壓，基底膜進一步增厚，系膜基質進一步增加，部分腎小球荒廢;Ⅴ期即終末期腎衰竭，腎小球濾過率嚴重減低，患者出現氮質血癥，水腫及高血壓加重，腎小球廣泛硬化、荒廢［6］。Ⅰ期、Ⅱ期糖尿病腎病僅靠臨床癥狀及各項生化檢測指標難以明確診斷分期，故本試驗選取Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期糖尿病腎病患者進行研究分析。本研究結果表明在2型糖病腎病患者中，血肌酐水平升高者較血肌酐正常者血清AGEs水平增高。血清AGEs隨著分期的進展而增高，Ⅲ期與Ⅳ期、Ⅴ期間存在著顯著差異。多元逐步回歸分析顯示2型糖尿病腎病患者血清AGEs水平與年齡無關，而與分期及HbA1c呈正相關，因Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期病程代表腎功能正常、腎小球濾過率下降、腎功能衰竭的腎功能進展惡化過程，可以認為在2型糖尿病患者中腎功能與長期血糖控制情況是影響血清AGEs的兩個因素，腎功能影響更為重要。如前所述，血清AGEs增高是由于產生增多和(或)降解清除減少所致。在2型糖病腎病腎功能損害患者這二方面因素皆存在。尤其Ⅳ期、Ⅴ期患者，腎小球濾過率明顯下降，更加重了AGEs的堆積。

AGEs主要的降解機制為機體多種細胞表面均存在著AGEs受體(AGER)，這些細胞尤其是單核巨噬細胞可以攝取AGEs，并將其降解和最終釋放出一種小分子可溶性 AGEs(LMW-AGE)。同樣細胞外基質中AGEs受蛋白酶降解，裂解成AGEs片段。這些AGEs降解產物釋放入血，由腎臟清除。AGEs在血液透析患者的心血管組織中蓄積，在腎移植患者中減少。提示AGEs蓄積不僅與高血糖(糖尿病)密切相關更與腎功能異常關系密切。AGEs在糖尿病腎病中的致病作用已得到證實。AGEs的以下作用與DN有關:(1)與腎小球系膜細胞上的特異性AGEs受體結合增加細胞因子的釋放和細胞外基質(ECM)的產生［7］;(2)與膠原蛋白發生交聯使蛋白質在組織中的沉積增加，降低基質降解酶活性使ECM成分降解減慢;(3)滅活一氧化氮(NO)，影響腎臟血流動力學，修飾脂蛋白與糖尿病動脈粥樣硬化發生密切相關;(4)損傷DNA和核酸蛋白影響蛋白質的轉錄和表達等。因此AGEs造成糖尿病腎病患者系膜基質堆積、腎小球和腎小管基底膜增厚，選擇性通透能力喪失和蛋白尿發生［8］。最終導致腎小球硬化。

1 劉志紅，黎磊石．探索糖尿病腎病防治的新途徑．腎臟病與透析腎移植雜志，2002，11:1-2．

2 Harrington CR，Colaco CA．Alzheimer’s disease．A glycation connection．Nature，1994，370:747．

3 Vlassara H，Palace MR．Diabetes and advanced glycation endproducts．J Int Med，2002，251:87-101．

4 Schiel R，Franke S，Busch M，etal．Effectof smoking on risk factors for cardiovascular disease in patientswith diabetesmellitusand renal insufficiency．Eur JMed Res，2003，8，283-291．

5 Bierhaus A，Schiekofer S，Schwaninger M，et al．Diabetes-associated sustained activation of the tranScription factor nuclear factor-kappa B．Diabetes，2001，50:2792-2808．

6 Mason RM，Wahab NA．Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy．JAm Soc Nephrol，2003，14:1358-1373．

7 Shibata K，Dohi K，Fnjii Y，et al．Intraglomerular eoagulation and fibrindysis in human Primiary glomerular diseses．Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33:719-729．

8 Shoji T，Koyama H，Morioka’T，et al．Recepter for advanced glycation end products is involved in impaired agniogenic response in diabetes．Diabetes，2006，55:2245-2255．